【摘要】：第一部分HSF1在人垂體促腎上腺皮質激素腺瘤組織標本中的表達及其臨床意義目的探究HSF1在人垂體促腎上腺皮質激素腺瘤中的表達及其潛在的臨床意義方法從馬普學會精神醫(yī)學中心臨床神經內分泌實驗室標本庫中收集的47例垂體促腎上腺皮質激素腺瘤和4例正常人垂體組織標本納入此項研究。使用免疫組織化學染色的方法在石蠟組織切片中進行HSF1的染色。使用半定量方法評估組化染色的強度。使用Graph Pad Prism 7.0進行臨床數(shù)據(jù)及HSF1表達水平的統(tǒng)計分析。結果47例垂體促腎上腺皮質激素腺瘤中共3例(6.38%)為男性患者,其余44例(93.62%)皆為女性患者。在39例已知腫瘤直徑的病例當中,14例(35.90%)為大腺瘤(平均腫瘤直徑15.86±4.67mm),25例(64.10%)為微腺瘤(平均腫瘤直徑7.68±1.91mm),其中3例大腺瘤、1例微腺瘤及1例腫瘤直徑未知病例為侵襲性腫瘤。主要激素水平如下:上午9點血清皮質醇水平827.2±290.4 nmol/ml,夜晚12點血清皮質醇水平653±347.7 nmol/ml,24小時尿游離皮質醇2488.6±1932.99 nmol/ml,上午9點ACTH水平99.77±52.23ng/ml。4例正常垂體組織及47例ACTH腺瘤中均可檢測出HSF1陽性染色細胞。通過半定量分析HSF1的染色強度,26例ACTH腺瘤(55.31%)中HSF1的染色強度高于正常垂體組織,21例ACTH腺瘤(44.69%)中的HSF1染色強度與正常垂體相近。通過統(tǒng)計分析,未能發(fā)現(xiàn)HSF1的表達水平與患者性別(p=0.8382)、腫瘤侵襲性(p=0.2374)、上午9點血清皮質醇水平(p=0.4627)、上午9點ACTH水平(p=0.6679)、24小時尿游離皮質醇(p=0.9048)、腫瘤直徑(p=0.5581)有顯著相關性。結論HSF1在人ACTH腺瘤中差異性表達,但普遍高于正常垂體組織,其表達水平對患者的激素水平及腫瘤特性并沒有顯著的關聯(lián)。第二部分HSF1在促腎上腺皮質激素腺瘤細胞模型中的活化狀態(tài)及其對細胞增殖和激素分泌的影響目的探究HSF1在促腎上腺皮質激素腺瘤細胞模型中的活化狀態(tài)及抑制HSF1對細胞增殖以及激素分泌的影響方法使用Western Blot和HSE-Luc報告基因檢測方法來檢測At T20細胞對熱休克刺激及HSF1抑制劑KRIBB11的反應。Cell Titer Glo試劑盒及細胞絕對計數(shù)的方法用來檢測KRIBB11對At T20細胞活性及細胞增殖的影響。流式細胞計數(shù)用來檢測KRIBB11對At T20細胞周期的影響。Caspase-Glo 3/7試劑盒用來檢測KRIBB11對細胞凋亡的影響。Pomc-Luc和Nur RE-Luc報告基因檢測方法用來檢測KRIBB11對At T20細胞Pomc啟動子活性的影響。實時定量PCR用來確定KRIBB11對Pomc轉錄的影響。放射免疫法用來檢測At T20細胞、小鼠原代垂體細胞、人促腎上腺皮質激素腺瘤原代培養(yǎng)細胞上清ACTH的濃度。HSF1小干擾RNA用來確認HSF1抑制劑對細胞活性及ACTH分泌的影響。結果熱休克刺激并不影響At T20細胞內HSF1的表達。與對照組相比,KRIBB11刺激會引起HSF1特異性條帶下移。熱休克刺激可以極大提高HSE的啟動子活性,HSP90的N末端抑制劑17-AAG則在非熱休克和熱休克刺激條件下均提高HSE的啟動子活性。KRIBB11處理會降低非熱休克和熱休克刺激條件下基礎狀態(tài)HSE啟動子活性或17-AAG激活的HSE啟動子活性。KRIBB11刺激也可以濃度或時間依賴性地降低At T20細胞的細胞活性,IC50為10μM。通過臺盼藍染色細胞絕對計數(shù)的方法也確認了KRIBB11對At T20細胞增殖的濃度依賴性抑制性作用。并且KRIBB11誘導At T20細胞G2/M期阻滯。KRIBB11也被發(fā)現(xiàn)在非細胞毒性濃度條件下并不影響細胞凋亡進程。KRIBB11可以降低基礎狀態(tài)或地塞米松刺激下的Pomc及Nur RE元件啟動子活性,此抑制效應也通過RT-PCR及兩條不同序列的HSF1小干擾RNA沉默所確認。此外,KRIBB11濃度依賴性地降低基礎狀態(tài)及小劑量地塞米松刺激下的At T20細胞上清ACTH的分泌,HSF1小干擾RNA沉默也可抑制細胞上清ACTH的分泌。而且,在4例原代培養(yǎng)的人ACTH腺瘤中,KRIBB11抑制了3例ACTH的分泌,但不與地塞米松產生疊加抑制效應。然而KRIBB11并不影響小鼠正常垂體原代培養(yǎng)細胞的ACTH分泌。結論HSF1在基礎狀態(tài)下的At T20細胞系內處于組成性活化狀態(tài),其活力可以被正負調節(jié)。在At T20細胞中,HSF1特異性抑制劑KRIBB11是通過抑制HSF1的活性來發(fā)揮其HSF1抑制作用。KRIBB11可以抑制At T20細胞活性及細胞增殖,誘導G2/M期阻滯,但并不影響細胞凋亡。此外,KRIBB11及HSF1小干擾RNA均可在體外降低促腎上腺皮質激素腺瘤細胞ACTH的分泌。HSF1可以作為庫欣病的潛在治療靶點。第三部分抑制HSF1調節(jié)糖皮質激素受體活性反式阻抑POMC的轉錄目的探討HSF1抑制對At T20細胞內糖皮質激素受體活性的調節(jié)作用方法MMTV-Luc報告基因法和實時定量PCR用來檢測GR激動劑地塞米松和HSF1抑制劑KRIBB11對At T20細胞內GR轉錄活性及表達的影響。細胞總蛋白Western Blot用來檢測HSF1失活后GR、HSP70蛋白水平的變化。細胞質蛋白和細胞核蛋白的Western Blot用來檢測地塞米松和HSF1抑制劑KRIBB11對At T20細胞內GR胞核轉運的影響。HSF1小干擾RNA用來確認HSF1抑制劑對GR活性造成的影響。結果與空白組或單獨地塞米松組相比,HSF1抑制劑KRIBB11能提高At T20細胞基礎狀態(tài)或地塞米松誘導下的MMTV報告基因活性,基礎狀態(tài)下的最大效應濃度為10μM,地塞米松誘導下KRIBB11 2.5μM也可提高3.2倍的MMTV報告基因活性。KRIBB11和地塞米松下調At T20細胞的GR轉錄水平,但延長藥物作用時間至24h則可逆轉此抑制效應。KRIBB11處理下的At T20細胞內Hsp70和Hsf1基因的轉錄下降。Western Blot顯示KRIBB11可以濃度依賴性的增加GR蛋白表達,但對HSP70蛋白的表達無明顯影響。蛋白酶體抑制劑MG132作用下,KRIBB11可以抑制蛋白酶體抑制劑MG132誘導的HSP70蛋白表達的增加,而蛋白翻譯抑制劑Cycloheximide作用下,KRIBB11并不影響HSP70蛋白的表達。此外檢測細胞質及細胞核組分,KRIBB11并不會增加地塞米松誘導的GR胞核轉運效應。兩條不同的沉默序列產生的HSF1的暫時沉默也會增加MMTV報告基因的活性、降低GR的轉錄水平、增加GR的蛋白表達。結論HSF1抑制可以增加糖皮質激素受體的轉錄活性及蛋白表達,激活GR對其自身基因轉錄的負反饋調節(jié)機制,發(fā)揮其對POMC基因的反式阻抑效應。
【圖文】：

正常垂體和ACTH腺瘤HSF1免疫組化染色（NP：正常垂體，，CUSH：ACTH

29圖 2：ACTH 腺瘤 HSF1 表達水平與患者性別、激素分泌水平及腫瘤直徑和侵襲性的相關性分析（AM cortisol：清晨 9 點皮質醇，UFC：24h 尿游離皮質醇）
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R736.4

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本文編號：2603431