發(fā)布時(shí)間：2020-03-13 19:23

【摘要】：目的:鹽酸埃克替尼(icotinib)為我國(guó)常用且有效的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)。由于其靶向性和低毒副作用的特點(diǎn),在臨床上EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的治療中取得了顯著的療效。但大多數(shù)病人在用藥9～15個(gè)月后會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥,這已成為臨床中亟需解決的問(wèn)題。很多研究表明EGFR-TKI耐藥與基因的變異有關(guān),主要包括單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和拷貝數(shù)變化(copy number variation,CNV)。與進(jìn)口的EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼相比,icotinib的分子結(jié)構(gòu)和體內(nèi)代謝途徑不同,因此icotinib的耐藥可能存在不同的耐藥機(jī)制。本研究利用全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)親本和icotinib耐藥細(xì)胞基因組進(jìn)行測(cè)序,尋找icotinib耐藥相關(guān)的基因組變異,并對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法:首先,我們選用具有EGFR-TKI敏感突變的NSCLC細(xì)胞株P(guān)C-9(EGFR 19外顯子E746-A750缺失),在體外采用icotinib濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9/icotinib resistance(IR)。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、蛋白印跡(Western blot,WB)和免疫熒光對(duì)耐藥細(xì)胞PC-9/IR進(jìn)行鑒定。然后提取PC-9和PC-9/IR細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行全外顯子測(cè)序,分析測(cè)序結(jié)果,找到差異的SNV,indel和CNV,并在DNA、mRNA、蛋白和細(xì)胞生物學(xué)水平對(duì)icotinib耐藥相關(guān)的SNP和CNV進(jìn)行驗(yàn)證。最后,為了驗(yàn)證得到的耐藥相關(guān)CNV(鈣蛋白酶7擴(kuò)增)是否為icotinib耐藥特異性的變化,我們選取了兩株EGFR-TKI耐藥細(xì)胞,A549(EGFR野生型,對(duì)EGFR-TKI原發(fā)性耐藥)和H1975(具有EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥突變EGFR T790M和敏感突變21外顯子L858R),在體外大劑量icotinib進(jìn)行誘導(dǎo)40周,在DNA、mRNA和蛋白水平對(duì)鈣蛋白酶7(calpain-7,CAPN7)在誘導(dǎo)前后的細(xì)胞模型中進(jìn)行驗(yàn)證,探討icotinib的耐藥機(jī)制。結(jié)果:經(jīng)過(guò)40周的icotinib誘導(dǎo)得到耐藥的NSCLC細(xì)胞PC-9/IR,與親本細(xì)胞相比,耐藥細(xì)胞PC-9/IR的形態(tài)由圓形變?yōu)樗笮?在同一藥物濃度下耐藥細(xì)胞的細(xì)胞活力高與親本,且PC-9/IR細(xì)胞的遷移速率,靶點(diǎn)蛋白磷酸化的EGFR表達(dá)水平明顯高于親本PC-9細(xì)胞。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)耐藥細(xì)胞中鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平,提示PC-9/IR并沒(méi)有發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。利用全外顯子測(cè)序,我們分別在PC-9和PC-9/IR細(xì)胞中鑒定出76,475和79,150個(gè) SNPs,10,228 和 10,891 個(gè)插入缺失變化(insertions and deletions,indels)。與PC-9比較我們得出了 PC-9/IR細(xì)胞中有差異的183個(gè)單核苷酸變異(single nucleotide variations,SNV)和10個(gè)indels。此外,我們還發(fā)現(xiàn)PC-9/IR細(xì)胞中出現(xiàn)的3個(gè)CNV的變化:CAPN7的擴(kuò)增,胰島素樣生長(zhǎng)因子2mRNA結(jié)合蛋白2(Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2,IGF2BP2)和 KIAA0922(也稱(chēng)為 transmembrane protein 131-like,TMEM131L)的缺失。我們?cè)贒NA、mRNA、蛋白和細(xì)胞學(xué)不同水平對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果證實(shí)PC-9/IR細(xì)胞中存在T790M和RAS/Raf信號(hào)通路激活,使用針對(duì)T790M的三代EGFR-TKIAZD9291,以及RAS/Raf通路抑制劑U0126可以抑制耐藥細(xì)胞的增殖。Real time PCR和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PC-9/IR細(xì)胞中CAPN7在基因組DNA水平拷貝數(shù)出現(xiàn)擴(kuò)增,在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均高于親本細(xì)胞。我們對(duì)EGFR-TKI耐藥細(xì)胞A549和H1975細(xì)胞用大劑量icotinib進(jìn)行了誘導(dǎo),得到了耐藥性更強(qiáng)的A549/IR和H1975/IR細(xì)胞。與誘導(dǎo)前相比,兩者CAPN7在DNA水平拷貝數(shù)均出現(xiàn)擴(kuò)增,提示CAPN7的擴(kuò)增可能為icotinib特異性作用的結(jié)果。在mRNA和蛋白水平,H1975/IR細(xì)胞中CAPN7的表達(dá)高于誘導(dǎo)前細(xì)胞,在EGFR野生型的A549/IR細(xì)胞中CAPN7的表達(dá)與誘導(dǎo)前相比無(wú)顯著性差異。結(jié)論:本研究成功建立了 icotinib耐藥的NSCLC細(xì)胞PC-9/IR。利用全外顯子測(cè)序技術(shù)分析PC-9/IR和PC-9細(xì)胞的基因組變異,通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了icotinib耐藥相關(guān)的183個(gè)SNVs,10個(gè)indels和3個(gè)CNVs,其中共有57個(gè)可能引起基因功能的變化。其中在PC-9/IR、A549/IR和H1975/IR細(xì)胞中,CAPN7在基因組DNA水平擴(kuò)增;在PC-9/IR和H1975/IR細(xì)胞中,CAPN7在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均高于誘導(dǎo)前細(xì)胞。以上結(jié)果提示我們CAPN7的擴(kuò)增和表達(dá)增加與icotinib耐藥相關(guān),并且可能是icotinib特異性誘導(dǎo)的結(jié)果。
【圖文】：

基的自磷酸化［８］。這些磷酸化的酪氨酸部分用作進(jìn)一步下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的�？垮义衔稽c(diǎn)，從而擴(kuò)大信息，激活細(xì)胞內(nèi)一系列的生化反應(yīng)，如細(xì)胞增殖，抗凋亡，血逡逑管生成等（圖１）。逡逑１逡逑

北京交通大學(xué)碩士學(xué)位論文邐引言逡逑與ＥＳＣＲＴ－ＩＩ和－ＩＩＩ相互結(jié)合，ＥＳＣＲＴ復(fù)合物促進(jìn)ＭＶＢ的膜內(nèi)陷，，使得ＥＧＦＲ進(jìn)逡逑入ＭＶＢ內(nèi)形成小囊泡，最后在晚期內(nèi)體／溶酶體中被降解［１（３］。綜上，ＥＧＦＲ的內(nèi)逡逑吞和降解是受網(wǎng)格蛋白所介導(dǎo)的磷酸化、泛素化和內(nèi)吞體膜上特定的蛋白協(xié)同調(diào)逡逑節(jié)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。逡逑ＯＯ－ＥＧＦ逡逑ＰｌａｓｍａＣｌａｔｈｒｉｎ－＾逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 薛麗;白玉杰;;EGFR基因突變與腫瘤靶向治療[J];中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué);2012年04期

2 劉軍;周意;萬(wàn)靜;劉忠;;表皮型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2012年03期

3 張華東;黃勇;李宏偉;熊正文;;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2011年31期

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本文編號(hào)：2586809