【摘要】：研究背景及目的肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)(以下簡稱肝癌或HCC)是常見的消化道惡性腫瘤。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的GLOBOCAN 2008資料顯示,在全球范圍內(nèi)HCC的發(fā)病率在男性位列第5位,在女性位列第7位;在癌癥相關(guān)死亡中位列第3位。我國是肝癌大國,肝癌病例數(shù)占世界的一半以上,肝癌的發(fā)病率和死亡率在腫瘤中均位居前列。近年來,以手術(shù)為主的綜合治療取得了一定效果,但術(shù)后肝癌患者仍高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率成為改善肝癌患者預(yù)后的主要障礙。即使是小肝癌(5cm)行根治切除或肝臟移植后3年復(fù)發(fā)率也高達(dá)50%以上�？焖僭鲋澈颓忠u轉(zhuǎn)移是肝癌重要的生物學(xué)特征,也是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后較差、5年生存率低的重要因素之一。因此,研究導(dǎo)致肝癌增殖、轉(zhuǎn)移的原因,揭示其相關(guān)機(jī)制對提高HCC患者預(yù)后有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子(Silent information regulator,Sirtuin)(Sirt)是一類由多個組蛋白去乙�；�(histonedeacetylase,HDAC)成員組成的蛋白家族。研究證實(shí)SIRT家族成員通過對組蛋白及多種非組蛋白進(jìn)行去乙�；揎梺碚{(diào)節(jié)基因的表達(dá),參與細(xì)胞分化、凋亡、衰老、能量代謝及應(yīng)激耐受等多種重要的生理活動,從而可能在腫瘤的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。對于SIRT家族在惡性腫瘤中生物學(xué)功能及其相關(guān)機(jī)制的探索有助于我們更全面的了解HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)理,尋找新的診治標(biāo)志物和相關(guān)靶點(diǎn)。SIRT5是沉默信息調(diào)節(jié)因子家族中的一員,近期研究報(bào)道其在乳腺癌和肺癌中可能發(fā)揮癌基因的作用,但其在早期腫瘤中的具體生物學(xué)功能,尤其是在肝癌中的作用尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬在高通量芯片篩選預(yù)后較差的HCC病例特異性差異表達(dá)的mRNA基礎(chǔ)上,利用qRT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測SIRT5在HCC中的表達(dá),明確其臨床意義,進(jìn)而進(jìn)一步利用體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)明確SIRT5在HCC中的生物學(xué)作用。由此闡明SIRT5在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用,為進(jìn)一步尋找肝癌早期診斷、預(yù)后判斷、確定治療決策的新的分子標(biāo)志物及靶向治療提供了理論依據(jù)。方法1、表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選肝癌及癌旁組織中差異表達(dá)的mRNA通過mRNA基因芯片技術(shù)分析8對肝癌組織及其配對癌旁組織中mRNA的差異表達(dá)譜,使用獨(dú)立樣本的t-test,初步篩選出與肝癌早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在功能mRNA,然后通過qRT-PCR的方法在大樣本量的早期復(fù)發(fā)、長期未復(fù)發(fā)肝癌,以及肝癌子灶及其配對組織中對隨機(jī)挑選的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測,通過與芯片結(jié)果進(jìn)行比對以對基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,最終篩選出在肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮作用的mRNA。2、SIRT5在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及意義采用免疫組織化學(xué)、熒光定量PCR和蛋白免疫抑制劑等實(shí)驗(yàn)方法檢測并分析HCC組織、癌旁組織中SIRT5的表達(dá)水平。采用student's t-test分析SIRT5在肝癌}D織及癌旁組織中表達(dá)有無差異,Chi-square test檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析其表達(dá)水平與臨床病理特征以及患者預(yù)后之間的關(guān)系,以期能夠初步了解SIRT5在HCC發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用。3、SIRT5對肝細(xì)胞肝癌生物學(xué)行為的影響首先利用qRT-PCR和Western blot方法檢測SIRT5在HCC細(xì)胞株中的表達(dá)水平,篩選出SIRT5高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株。在SIRT5高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株中利用慢病毒干擾技術(shù)沉默SIRT5的表達(dá),利用CCK-8、克隆形成、Transwell、等體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)探明SIRT5對HCC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響。然后利用流式細(xì)胞技術(shù)、Western blot等技術(shù)檢測SIRT5對HCC細(xì)胞周期和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的影響,以初步明確SIRT5在調(diào)控HCC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移中的可能機(jī)制。4、SIRT5對肝細(xì)胞肝癌增殖、轉(zhuǎn)移能力影響的體內(nèi)研究利用上一部分構(gòu)建的穩(wěn)定沉默SIRT5的HCC細(xì)胞株,在裸鼠中皮下注射HCC細(xì)胞或經(jīng)尾靜脈注射HCC細(xì)胞,進(jìn)而構(gòu)建皮下種植瘤模型和血道轉(zhuǎn)移模型。記錄皮下成瘤小鼠的腫瘤體積,測量其腫瘤質(zhì)量,并檢測裸鼠皮下成瘤細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平;同時記錄血道轉(zhuǎn)移模型小鼠體重增長情況和肝臟腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移病灶形成情況。最終在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明SIRT5在HCC進(jìn)展中的具體作用,以確定SIRT5在小鼠體內(nèi)更為復(fù)雜的環(huán)境下的功能。結(jié)果1、mRNA在早期復(fù)發(fā)肝癌及肝癌子灶中的表達(dá)情況我們利用羅氏mRNA芯片檢測4例早期復(fù)發(fā)(≤3個月)的新鮮HCC腫瘤及其配對(性別、年齡、分期)的4例無早期復(fù)發(fā)(≥2年)的HCC腫瘤組織;同時,也檢測了 4對多病灶的原發(fā)HCC的子灶組織及其癌旁組織。通過聚類分析篩選出兩組芯片結(jié)果中差異表達(dá)的mRNA。以升高、降低2倍為截?cái)嘀?在早期復(fù)發(fā)的肝癌組織中,發(fā)現(xiàn)與無早期復(fù)發(fā)病例相比有2665個差異表達(dá)mRNA,同時另一組的子灶和癌旁組織相比發(fā)現(xiàn)有3065個差異表達(dá)mRNA,兩組篩選結(jié)果取交集,獲得特異性高表達(dá)/低表達(dá)的mRNA。從芯片所篩選出差異表達(dá)的m R N A中隨機(jī)選取5個,進(jìn)一步采用qRT-PCR的方法在20對肝癌組織及配對癌旁組織,以及20對早期復(fù)發(fā)、晚期復(fù)發(fā)的HCC組織中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在20對HCC子灶組織以及20對早期復(fù)發(fā)HCC組織中均明顯升高,且qRT-PCR所檢測的mRNA的表達(dá)水平排序與芯片結(jié)果基本一致,證明了基因芯片的可靠性。2、SIRT5在HCC組織中高表達(dá)并與預(yù)后相關(guān)我們首先利用qRT-PCR的方法在55對新鮮肝癌組織及其配對癌旁組織中檢測SIRT5的表達(dá)情況,同時利用免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)在166例HCC石蠟切片中檢測SIRT5蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示SIRT5 mRNA在肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0015);IHC檢測發(fā)現(xiàn)大部分HCC病例中SIRT5在肝癌組織中表達(dá)成明顯的陽性,主要在細(xì)胞漿中,并根據(jù)IHC染色強(qiáng)度,分為完全陰性、陽性,以及強(qiáng)陽性。通過Spearman秩相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)SIRT5 mRNA表達(dá)與肝癌患者腫瘤直徑(P = 0.019),腫瘤數(shù)目(P = 0.027),以及TNM分期腫瘤數(shù)目(P = 0.009)存在相關(guān)性,而與性別、年齡、病理分級、門脈癌栓、AFP、肝硬化、均無顯著相關(guān)性;而SIRT5 IHC染色評分也與肝癌患者腫瘤直徑(P = 0.009),腫瘤數(shù)目(P = 0.015),TNM分期(P = 0.007)存在相關(guān)性,而與性別、年齡、門脈癌栓、AFP、肝硬化、病理分級等均無顯著相關(guān)性。Kaplan-Meier生存曲線分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT5的表達(dá)水平與HCC患者總生存時間與無病生存時間存在相關(guān)性,SIRT5高表達(dá)提示預(yù)后不良。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型證實(shí)SIRT5高表達(dá)是HCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。3、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默SIRT5抑制HCC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力慢病毒轉(zhuǎn)染沉默HepG2和Huh7中SIRT5的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞的增殖、克隆形成和穿透Transwell小室的能力均顯著下降。流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)SIRT5低表達(dá)導(dǎo)致HCC細(xì)胞發(fā)生G/S期阻滯,且qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的周期蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6表達(dá)隨SIRT5沉默而下降;此外,qRT-PCR和Western blot也發(fā)現(xiàn)SIRT5低表達(dá)后HCC細(xì)胞上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)升高,而間充質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平隨之下降。4、動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默SIRT5導(dǎo)致HCC細(xì)胞體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移能力下降與對照組相比,SIRT5沉默組小鼠皮下成瘤腫瘤生長速度明顯減慢,體積明顯減小。小鼠生長共3個月后統(tǒng)一處死,腫瘤稱重,結(jié)果顯示SIRT5沉默組腫瘤質(zhì)量明顯低于對照組。小鼠處死,腫瘤稱重后抽提組織RNA與蛋白,通過PCR與WB檢測細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的改變。記過顯示,與對照組相比,在沉默SIRT5的皮下成瘤組織中促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的周期蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯下降;同時沉默SIRT5的皮下成瘤組織中間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin與Vimentin的mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯下降,而上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平相應(yīng)升高。血道轉(zhuǎn)移模型中,沉默SIRT5組小鼠基本未見肝轉(zhuǎn)移,其中5只未發(fā)現(xiàn)肉眼可見肝轉(zhuǎn)移病灶,而對照細(xì)胞組7只均發(fā)現(xiàn)肉眼可見肝轉(zhuǎn)移病灶,兩組肝轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1、SIRT5在HCC組織中高表達(dá),并且是HCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素,是預(yù)測肝癌患者預(yù)后的有價值的分子標(biāo)志物。2、SIRT5可能通過促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。3、動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIRT5促進(jìn)HCC腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。
【圖文】：

以及２０對早期復(fù)發(fā)、晚期復(fù)發(fā)的ＨＣＣ組織中的表達(dá)水平，驗(yàn)證是否與芯片結(jié)逡逑果一致，結(jié)果顯示其表達(dá)水平在ＨＣＣ子灶組織以早期復(fù)發(fā)ＨＣＣ組織中均明顯升逡逑高（圖１－２），且ｑＲＴ－ＰＣＲ所驗(yàn)證ｍＲＮＡ的表達(dá)水平排序與芯片結(jié)果基本一致（圖逡逑１－３），證明了基因芯片的可靠性。逡逑表１－５隨機(jī)挑選的５個驗(yàn)證用ｍＲＮＡｓ逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｒａｎｄｏｍｌｙ邋ｓｅｌｅｃｔｅｄ邋ｔｅｎ邋ｍＲＮＡｓ邋ｕｓｅｄ邋ｆｏｒ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ逡逑Ｎｏ．邋Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ邐Ｆｕｌｌ邋ｎａｍｅ逡逑１邐ＮＦＥ２邐１８邐Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｆａｃｔｏｒ，邋ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ邋２邐１逡逑２邐ＰＬＳ１邐１３１邐Ｐｌａｓｔｉｎ邐１邐４逡逑３邐ＣＸＣＬ１６邐２邋］邋９邐Ｃ－Ｘ－Ｃ邐ｍｏｔｉｆ邋ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邐ｌｉｇａｎｄ邋１６邐５逡逑４邐ＢＡＴＦ邐３６．９邐ｂａｓｉｃ邐ｌｅｕｃｉｎｅ邋ｚｉｐｐｅｒ邐ＡＴＦ－ｌｉｋｅ邐３逡逑ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｆａｃｔｏｒ逡逑５邐ＭＥＴ邐２４邐ＭＥＴ邐ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ，，邐ｒｅｃｅｐｔｏｒ邐２逡逑邐ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｋｉｎａ

邐＊逡逑＇Ｊ＿＿：邋＾邋0￣邋0Ｊ＿＿；邋．．＾．邋■逡逑圖１－２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測２０對早期復(fù)發(fā)肝癌（ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ邋ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ，邋ＳＴＲ）及長期未復(fù)發(fā)肝癌組逡逑織（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ邋ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ，ＬＴＲ），以及邋２０邋對肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移子灶（ｉｎｔｒｈｅｐａｔｉｃ邋ｍｅｔａｓｉａｓｉｓ，ＩＭ）逡逑和癌旁正常組織（ｐａｒａ－ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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10 張國強(qiáng);楊定華;李相z

本文編號：2578945