【摘要】：背景MicroRNA是指一系列長度估計在19-25個核苷酸的非編碼小分子RNA,在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性,在功能上MicroRNA通過與目標(biāo)mRNA的3’末端非翻譯區(qū)特異性結(jié)合【1】,進(jìn)而引起目標(biāo)MicroRNA的降解或者翻譯抑制。另外,MicroRNA的結(jié)合區(qū)域現(xiàn)在被證實不僅僅限于3'-UTR,在基因的5'-UTR、編碼區(qū)以及啟動子均發(fā)現(xiàn)有MicroRNA結(jié)合序列,這提示,MicroRNA和基因是一對多的關(guān)系,即一種miRNA可以調(diào)控多達(dá)上百種的目的基因。也正是通過這種作用,MicroRNAA參與調(diào)控包括細(xì)胞增殖,分化,衰老,凋亡在內(nèi)的多種細(xì)胞進(jìn)程。甲狀腺癌是人類最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,女性發(fā)病率明顯高于男性,而且近年來,不管是在我國還是北美地區(qū)都成為發(fā)展速度最快的腫瘤之一【2】,而在甲狀腺癌中,以甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)最為常見,幾乎占到所有甲狀腺癌的九成以上,而且通過規(guī)范的手術(shù)治療和術(shù)后治療,預(yù)后較好。自噬是細(xì)胞的一種在饑餓、能量代謝缺乏等應(yīng)激狀況下發(fā)生自我吞噬進(jìn)而獲取所需物質(zhì)來維持細(xì)胞基本生命活動的過程,它表現(xiàn)在細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量包裹著蛋白質(zhì)(一般指長壽命蛋白,短壽命蛋白一般由蛋白酶體途徑消化降解)和細(xì)胞器的雙層膜性空泡結(jié)構(gòu)和溶酶體,對空泡內(nèi)成分的降解而轉(zhuǎn)變成為機(jī)體所需要的能量物質(zhì)【3】,通過降解胞內(nèi)蛋白,實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要,完成細(xì)胞器的轉(zhuǎn)化和更新,是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)方式之一,并廣泛存在于生命進(jìn)化的過程當(dāng)中。細(xì)胞自噬與多種疾病的有著緊密的聯(lián)系,而腫瘤則是最早被發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的疾病之一【4】。在本課題的前期研究中,通過應(yīng)用高通量的Micro RNA芯片篩選出了不同分期的甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織中具有差別性表達(dá)的Micro RNA時發(fā)現(xiàn),microRNA-146b-5p在早期和中晚期甲狀腺乳頭狀癌組織中均持續(xù)表達(dá),而且其表達(dá)水平隨著腫瘤分期的上升而有升高的趨勢,這一證據(jù)提示該miRNA可能在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。在接下來的實驗中證實,過表達(dá)的microRNA-146b-5p能夠促進(jìn)PTC細(xì)胞的增殖和侵襲能力。而本研究旨在通過對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株使用慢病毒質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)而microRNA-146b-5p穩(wěn)定過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞株,之后利用透射電鏡,細(xì)胞免疫熒光技術(shù),Western blot技術(shù),探討microRNA-146b-5p對TPC-1細(xì)胞株自噬的影響。目的本實驗通過慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)獲得了mir-146b-5p高表達(dá)株,結(jié)合前期實驗得到的慢病毒侵染mir-146b-5p低表達(dá)株和空白TPC-1細(xì)胞株,旨在前期研究mir-146b-5p和TPC-1生物學(xué)行為關(guān)系的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究mir-146b-5p和TPC-1細(xì)胞自噬的關(guān)系,得出結(jié)論后,為下一步研究自噬對TPC-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以及mir-146b-5p是否通過影響自噬進(jìn)而影響TPC-1的生物學(xué)行為打下理論基礎(chǔ)。方法1.構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的mir-146b-5p過表達(dá)和低表達(dá)TPC-1細(xì)胞單克隆:(1)構(gòu)建mir-146b-5p過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒(2)將mir-146b-5p過表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入TPC-1細(xì)胞中,獲取mir-146b-5p穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞單克隆(3)由于前期實驗已經(jīng)取得microRNA-146b-5p低表達(dá)的TPC-1細(xì)胞株,故無需再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗2.研究microRNA-146b-5p對TPC-1細(xì)胞自噬的影響(1)分組:microRNA-146b-5p低表達(dá)組,TPC-1細(xì)胞組,miRNA-146b-5P過表達(dá)組(2)應(yīng)用透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體的形成(3)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測各組細(xì)胞中LC3蛋白點狀聚集程度的變化(4)Western blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II水平(5)Western blot技術(shù)檢測自噬特異性底物p62/SQSTM1水平結(jié)果(1)透射電鏡下觀察microRNA-146b-5p上調(diào)組,正常組,下調(diào)組三組細(xì)胞的自噬情況,觀察到三組自噬程度有差異且自噬數(shù)量:下調(diào)組正常組上調(diào)組。(P0.05)(2)Western blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II/I水平有差異且從高到低依次是:microRNA-146b-5p下調(diào)組microRNA-146b-5p正常組microRNA-146b-5p上調(diào)組。(3)Western blot技術(shù)檢測自噬特異性底物p62/SQSTM1水平有差異且從低到高依次是:microRNA-146b-5p下調(diào)組microRNA-146b-5p正常組microRNA-146b-5p上調(diào)組。(4)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測各組細(xì)胞中LC3蛋白點狀聚集程度的熒光定量大小有差異且由高到低依次是:microRNA-146b-5p下調(diào)組microRNA-146b-5p正常組microRNA-146b-5p上調(diào)組結(jié)論本實驗通過透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬,Western blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3和自噬特異性底物p62/SQSTM1,細(xì)胞免疫熒光檢測各組細(xì)胞中LC3蛋白點狀聚集程度,以上實驗結(jié)果通過不同角度得出結(jié)論microRNA-146b-5能夠抑制TPC-1細(xì)胞的自噬,但是通過何種通路和靶基因產(chǎn)生這種作用以及能否通過這種作用和TPC-1的其他生物學(xué)特性能否聯(lián)系起來,尚待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖 2. miRNA-146b-5p 擴(kuò)增曲線A1、A2 為 microRNA up 組的 miRNA-146b-5p 擴(kuò)增曲線B1、B2 為 NC 組 miRNA-146b-5p 擴(kuò)增曲線

34圖 5. Western blot 技術(shù)檢測各組細(xì)胞自噬標(biāo)記物 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ的水平以及 LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達(dá)量A microRNA-146b-5p 正常組B microRNA-146b-5p 上調(diào)組C microRNA-146b-5p 下調(diào)組
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R736.1

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本文編號：2576802