發(fā)布時(shí)間：2020-01-25 14:35

【摘要】：背景：胃癌(Gastric Cancer,GC)是四大最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類健康。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中及治療過程中有許多表觀遺傳學(xué)改變,可導(dǎo)致細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等信號通路的異常以及影響對腫瘤的進(jìn)一步治療。組蛋白去乙�；窰DAC1在表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有重要作用,并且在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高,但其在胃癌中怎樣影響細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞對化療藥物的反應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究。目的：第一部分研究：已有研究表明阿霉素與HDAC抑制劑聯(lián)用具有協(xié)同作用,但其相互作用的分子機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)意在明確胃癌中HDAC1在阿霉素作用下受表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的分子機(jī)制以及HDAC1在阿霉素抗腫瘤過程中發(fā)揮生物學(xué)作用的分子機(jī)制。第二部分研究：已有研究表明在胃癌中HDAC1表達(dá)增高,但]SDAC1在胃癌惡化過程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)意在探索HDAC1作為表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分子抑制胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制以及HDAC抑制劑(HDACi)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。兩部分研究試圖分別從HDAC1對化療藥物作用下的胃癌細(xì)胞的影響及HDAC1對胃癌細(xì)胞自發(fā)凋亡的影響兩個(gè)方面綜合闡釋HDAC1促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展與耐藥的表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制。方法：第一部分研究：首先通過western blot檢測了胃癌細(xì)胞在接受阿霉素處理后HDAC1蛋白表達(dá)量的變化。進(jìn)一步通過軟件篩選及RT-qPCR方法找出在阿霉素處理后影響HDAC1表達(dá)的microRNA,并從功能與結(jié)構(gòu)兩方面驗(yàn)證該microRNA對HDAC1的調(diào)控。MTS細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)證實(shí)HDAC1對阿霉素敏感性的影響。最后用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證HDAC1對阿霉素?fù)p傷DNA作用的影響。第二部分研究：首先通過western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測HDAC抑制劑曲古霉素A(TSA)處理后胃癌中caspase2凋亡信號通路的激活。RT-PCR及western blot檢測TSA處理后CRADD的表達(dá),進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證CRADD在TSA誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的作用。免疫組化染色分析胃癌中CRADD的表達(dá)。接下來運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)等確認(rèn)CRADD對胃癌的生長抑制作用。最后應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP實(shí)驗(yàn)等證明在胃癌中HDAC1可以直接調(diào)控CRADD的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果：第一部分研究揭示了胃癌中HDAC1在阿霉素作用下的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制以及其在阿霉素抗腫瘤作用中的影響。我們發(fā)現(xiàn)阿霉素通過增高miR-520h的表達(dá),miR-520h靶向I HDAC1 3'UTR,繼而特異性地下調(diào)HDAC1蛋白的表達(dá),進(jìn)而使得染色質(zhì)疏松,促進(jìn)了阿霉素嵌入DNA結(jié)構(gòu)中,加劇了阿霉素誘導(dǎo)的DNA損傷作用,最終進(jìn)一步殺傷胃癌細(xì)胞。第二部分研究闡述了胃癌中HDAC1調(diào)控凋亡信號通路的表觀遺傳學(xué)機(jī)制及功能。我們發(fā)現(xiàn)在胃癌中HDAC1通過促進(jìn)CRADD的轉(zhuǎn)錄表達(dá),最終激活Caspase 2并促進(jìn)Caspase 2依賴的細(xì)胞凋亡。結(jié)論：本篇論文從多角度多方向闡釋了組蛋白去乙�；窰DAC1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制與功能,為HDAC抑制劑治療腫瘤提供了新的表觀遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

用ＭＴＳ細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)明確了阿霉素的化巧效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其的確可１＾NB殺傷胃癌細(xì)胞系逡逑ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８，并且殺圼作用呈濃度及時(shí)間依賴性，在４山ＶＩ濃度的阿霉素作逡逑用７２小時(shí)后，胃癌細(xì)胞的存活率化于１０％（圖１Ａ和化）。接下來通過ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑檢測了胃癌細(xì)胞在接受阿霉素處理后ＨＤＡＣＩ類家族的幾種蛋白表達(dá)量的變化，有逡逑意思的是，我們發(fā)現(xiàn)ＨＤＡＣ１蛋白有明顯下調(diào)，而同家族的ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、逡逑ＨＤＡＣ８卻沒有明顯變化（圖１Ｃ），這提示著胃癌中阿霉素可能引起特異性的逡逑ＨＤＡＣ１蛋白表達(dá)下調(diào)？進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)４ｎＭ的阿霉素最早引起ＨＤＡＣ１蛋白下逡逑調(diào)開始的時(shí)間是在處理后第４－６小時(shí)（圖１Ｄ），考an到這一時(shí)間明顯短于一般蛋白逡逑質(zhì)降解所需要的時(shí)間，所Ｗ提示ＨＤＡＣ１蛋白的下調(diào)可能不是由于阿霉素促進(jìn)其蛋逡逑白質(zhì)降解所引起的。逡逑４０逡逑

ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ，邋ｍｉＲ－５８４，邋ｍｉＲ－＾Ｏｇ，邋ｍｉＲ－５１９ｃ－５ｐ，ｍｉＲ－５１２－５ｐ，邋ｍｉＲ－５１１，ｍｉＲ－＂０，逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ。運(yùn)用ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測后發(fā)現(xiàn)，在這些ｍｉｃｒｏＲＮＡ中只有ｍｉＲ－５２０ｈ在阿霉逡逑素處理后有明顯上調(diào)（圖３Ａ），因此我們進(jìn)一步重點(diǎn)研究胃癌中阿霉素處理后逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ與勝）ＡＣ１的關(guān)系。首先，通過ＲＴ－ｑＰＣＲ在ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８細(xì)胞中逡逑再次分別驗(yàn)證ｍｉＲ－５２０ｈ可被阿霉秦上調(diào)表達(dá)量（圖犯）。然后通過ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑栓測發(fā)現(xiàn)用５０邋ｎＭ濃度的ｍｉＲ－５２０ｈ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ抑制ｍｉ民－５２０ｈ后可Ｗ逆轉(zhuǎn)ＭＫＮ４５和逡逑ＭＫＮ２８細(xì)胞中阿霉素誘導(dǎo)的ＨＤＡＣ１蛋白下調(diào)（圖３Ｃ），，并且在這當(dāng)細(xì)胞系中用逡逑１０邋ｎＭ邋或邋２０邋ｎＭ邋濃度的邋ｍｉＲ－５２０ｈ邋ｍｉｍｉｃｓ邋模擬巧源性邋ｍｉＲ－５２０ｈ邋可ＬN(yùn)B下調(diào)邋ＨＤＡＣ１逡逑蛋白的表達(dá)量（圖３Ｄ），這些結(jié)果提示阿霉素通過上調(diào)ｍｉＲ－５２０ｈ來下調(diào)ＨＤＡＣ１逡逑的表達(dá)。逡逑接下來運(yùn)用雙巧光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步從結(jié)構(gòu)上證明ＨＤＡＣ１的確是逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ的目標(biāo)基因之一。雙巧光素酶報(bào)告載體表達(dá)后自身發(fā)出巧光，可被巧光逡逑酶標(biāo)儀檢測并相對定量。運(yùn)用分子克隆技術(shù)將包含ｍｉＲ－５２化粗向結(jié)合序列的逡逑ＨＤＡＣ１邋３’－Ｕｒｍ序列克隆入雙巧光素酶報(bào)告載體ｐＭＩＲ－ＲＥＰＯＲＴ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ質(zhì)粒；逡逑同時(shí)再構(gòu)建另一個(gè)類似的突變型質(zhì)粒，僅將ｍｉＲ－５２０ｈ乾向結(jié)合序列關(guān)鍵位置＂種逡逑子序列＂的關(guān)鍵堿基做點(diǎn)突變（圖３Ｅ
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：2573030