【摘要】：背景：胃癌(Gastric Cancer,GC)是四大最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅人類健康。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中及治療過程中有許多表觀遺傳學改變,可導致細胞生長、增殖、分化、凋亡等信號通路的異常以及影響對腫瘤的進一步治療。組蛋白去乙�；窰DAC1在表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡中有重要作用,并且在多種惡性腫瘤中表達增高,但其在胃癌中怎樣影響細胞凋亡以及細胞對化療藥物的反應仍有待進一步研究。目的：第一部分研究：已有研究表明阿霉素與HDAC抑制劑聯(lián)用具有協(xié)同作用,但其相互作用的分子機制尚未明確。本實驗意在明確胃癌中HDAC1在阿霉素作用下受表觀遺傳網(wǎng)絡調(diào)控的分子機制以及HDAC1在阿霉素抗腫瘤過程中發(fā)揮生物學作用的分子機制。第二部分研究：已有研究表明在胃癌中HDAC1表達增高,但]SDAC1在胃癌惡化過程中發(fā)揮作用的分子機制尚未明確。本實驗意在探索HDAC1作為表觀遺傳網(wǎng)絡調(diào)控分子抑制胃癌細胞凋亡的分子機制以及HDAC抑制劑(HDACi)促進胃癌細胞凋亡的表觀遺傳學機制。兩部分研究試圖分別從HDAC1對化療藥物作用下的胃癌細胞的影響及HDAC1對胃癌細胞自發(fā)凋亡的影響兩個方面綜合闡釋HDAC1促進胃癌的發(fā)生發(fā)展與耐藥的表觀遺傳學分子機制。方法：第一部分研究：首先通過western blot檢測了胃癌細胞在接受阿霉素處理后HDAC1蛋白表達量的變化。進一步通過軟件篩選及RT-qPCR方法找出在阿霉素處理后影響HDAC1表達的microRNA,并從功能與結構兩方面驗證該microRNA對HDAC1的調(diào)控。MTS細胞存活實驗證實HDAC1對阿霉素敏感性的影響。最后用流式細胞術驗證HDAC1對阿霉素損傷DNA作用的影響。第二部分研究：首先通過western blot及流式細胞術檢測HDAC抑制劑曲古霉素A(TSA)處理后胃癌中caspase2凋亡信號通路的激活。RT-PCR及western blot檢測TSA處理后CRADD的表達,進一步用流式細胞術驗證CRADD在TSA誘導的胃癌細胞凋亡中的作用。免疫組化染色分析胃癌中CRADD的表達。接下來運用克隆形成實驗等確認CRADD對胃癌的生長抑制作用。最后應用染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP實驗等證明在胃癌中HDAC1可以直接調(diào)控CRADD的轉(zhuǎn)錄。結果：第一部分研究揭示了胃癌中HDAC1在阿霉素作用下的表觀遺傳學調(diào)控機制以及其在阿霉素抗腫瘤作用中的影響。我們發(fā)現(xiàn)阿霉素通過增高miR-520h的表達,miR-520h靶向I HDAC1 3'UTR,繼而特異性地下調(diào)HDAC1蛋白的表達,進而使得染色質(zhì)疏松,促進了阿霉素嵌入DNA結構中,加劇了阿霉素誘導的DNA損傷作用,最終進一步殺傷胃癌細胞。第二部分研究闡述了胃癌中HDAC1調(diào)控凋亡信號通路的表觀遺傳學機制及功能。我們發(fā)現(xiàn)在胃癌中HDAC1通過促進CRADD的轉(zhuǎn)錄表達,最終激活Caspase 2并促進Caspase 2依賴的細胞凋亡。結論：本篇論文從多角度多方向闡釋了組蛋白去乙�；窰DAC1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的表觀遺傳學調(diào)控機制與功能,為HDAC抑制劑治療腫瘤提供了新的表觀遺傳學理論基礎。
【圖文】：

用ＭＴＳ細胞存活實驗明確了阿霉素的化巧效應，發(fā)現(xiàn)其的確可１＾NB殺傷胃癌細胞系逡逑ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８，并且殺圼作用呈濃度及時間依賴性，在４山ＶＩ濃度的阿霉素作逡逑用７２小時后，胃癌細胞的存活率化于１０％（圖１Ａ和化）。接下來通過ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑檢測了胃癌細胞在接受阿霉素處理后ＨＤＡＣＩ類家族的幾種蛋白表達量的變化，有逡逑意思的是，我們發(fā)現(xiàn)ＨＤＡＣ１蛋白有明顯下調(diào)，而同家族的ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、逡逑ＨＤＡＣ８卻沒有明顯變化（圖１Ｃ），這提示著胃癌中阿霉素可能引起特異性的逡逑ＨＤＡＣ１蛋白表達下調(diào)？進一步的研究發(fā)現(xiàn)４ｎＭ的阿霉素最早引起ＨＤＡＣ１蛋白下逡逑調(diào)開始的時間是在處理后第４－６小時（圖１Ｄ），考an到這一時間明顯短于一般蛋白逡逑質(zhì)降解所需要的時間，所Ｗ提示ＨＤＡＣ１蛋白的下調(diào)可能不是由于阿霉素促進其蛋逡逑白質(zhì)降解所引起的。逡逑４０逡逑

ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ，邋ｍｉＲ－５８４，邋ｍｉＲ－＾Ｏｇ，邋ｍｉＲ－５１９ｃ－５ｐ，ｍｉＲ－５１２－５ｐ，邋ｍｉＲ－５１１，ｍｉＲ－＂０，逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ。運用ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測后發(fā)現(xiàn)，在這些ｍｉｃｒｏＲＮＡ中只有ｍｉＲ－５２０ｈ在阿霉逡逑素處理后有明顯上調(diào)（圖３Ａ），因此我們進一步重點研究胃癌中阿霉素處理后逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ與勝）ＡＣ１的關系。首先，通過ＲＴ－ｑＰＣＲ在ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８細胞中逡逑再次分別驗證ｍｉＲ－５２０ｈ可被阿霉秦上調(diào)表達量（圖犯）。然后通過ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑栓測發(fā)現(xiàn)用５０邋ｎＭ濃度的ｍｉＲ－５２０ｈ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ抑制ｍｉ民－５２０ｈ后可Ｗ逆轉(zhuǎn)ＭＫＮ４５和逡逑ＭＫＮ２８細胞中阿霉素誘導的ＨＤＡＣ１蛋白下調(diào)（圖３Ｃ），，并且在這當細胞系中用逡逑１０邋ｎＭ邋或邋２０邋ｎＭ邋濃度的邋ｍｉＲ－５２０ｈ邋ｍｉｍｉｃｓ邋模擬巧源性邋ｍｉＲ－５２０ｈ邋可ＬNB下調(diào)邋ＨＤＡＣ１逡逑蛋白的表達量（圖３Ｄ），這些結果提示阿霉素通過上調(diào)ｍｉＲ－５２０ｈ來下調(diào)ＨＤＡＣ１逡逑的表達。逡逑接下來運用雙巧光素酶報告系統(tǒng)進一步從結構上證明ＨＤＡＣ１的確是逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ的目標基因之一。雙巧光素酶報告載體表達后自身發(fā)出巧光，可被巧光逡逑酶標儀檢測并相對定量。運用分子克隆技術將包含ｍｉＲ－５２化粗向結合序列的逡逑ＨＤＡＣ１邋３’－Ｕｒｍ序列克隆入雙巧光素酶報告載體ｐＭＩＲ－ＲＥＰＯＲＴ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ質(zhì)粒；逡逑同時再構建另一個類似的突變型質(zhì)粒，僅將ｍｉＲ－５２０ｈ乾向結合序列關鍵位置＂種逡逑子序列＂的關鍵堿基做點突變（圖３Ｅ
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：2573030