【摘要】：研究背景目前,非小細胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病率約占全部肺部腫瘤發(fā)生率的80%-85%,是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的腫瘤疾病。盡管最近10年,我們在肺癌發(fā)生的分子生物學機制的研究方面取得了長足的進步,并采取了包括手術切除、傳統(tǒng)化療、放療、分子靶向治療及免疫治療等綜合治療手段,但是患者的5年生存率依然沒有明顯的改善,只有15.9%的肺癌患者能存活5年以上,絕大多數(shù)患者死于腫瘤的復發(fā)與轉移。目前學術界普遍接受腫瘤干細胞假說:在惡性腫瘤組織中存在著具有干細胞樣特性的細胞亞群,即腫瘤干細胞樣細胞(cancer stem-like cells,CSLCs)或稱腫瘤起始細胞(tumor initiating cells,TICs),其不僅具有自我更新和多向分化的能力,而且與腫瘤的發(fā)生、轉移、復發(fā)及放化療抵抗密切相關。腫瘤干細胞樣細胞的存在已經(jīng)在造血系統(tǒng)腫瘤及肺癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質瘤等多種實體惡性腫瘤的研究中得到了證實。目前多通過無血清懸浮培養(yǎng)成球富集技術或者利用細胞表面標志物進行流式細胞分選,對腫瘤干細胞樣細胞進行分離與鑒定。研究顯示,肺癌干細胞樣細胞的細胞表面標志物主要包括:CD133+、CD326+、CD44+、CD166+、ALDH1A1+、Sca1+/CD34+(小鼠),等。這些表面標志物單獨或者共表達在腫瘤細胞表面,作為腫瘤干細胞樣細胞的識別分子,為以腫瘤干細胞樣細胞為靶細胞的根治性研究提供了突破口。上皮細胞間質樣改變(EMT)是指細胞形態(tài)從上皮細胞向間質細胞表型轉化的過程。大量研究發(fā)現(xiàn),EMT不僅參與胚胎發(fā)育、器官纖維化,并且在腫瘤侵襲和轉移中也起著重要作用。在腫瘤細胞發(fā)生EMT的過程中,原來在上皮細胞表面表達的標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達減少,反而間質細胞表面標志物如波形蛋白(vimentin)、N型鈣粘蛋白(N-cadherin)等表達上調(diào),細胞失去極性,細胞間的連接變得疏松,胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組,細胞的運動能力增加,進而促進腫瘤的侵襲與轉移。EMT的過程受Wnt、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Notch等多種信號通路的調(diào)節(jié)。近年來的研究表明,microRNAs(mi RNAs)也參與腫瘤EMT過程。miRNAs是一類長約19~22個核苷酸(nt)的非編碼單鏈小分子RNA。大量的研究證實,miRNAs通過誘導目的mRNA降解或抑制其翻譯蛋白,在轉錄后水平調(diào)控該基因表達,發(fā)揮著類似癌基因與抑癌基因的角色,顯示其作為腫瘤標志物、預后判斷、療效監(jiān)測以及腫瘤靶向治療新靶點的廣闊應用前景。目前有研究表明,mi RNAs也參與到腫瘤EMT過程中的各個環(huán)節(jié),miR-200家族通過調(diào)控ZEB基因的表達在抑制腫瘤EMT過程中起重要作用;而miR-214通過PI3K/AKT通路可誘導卵巢癌細胞發(fā)生EMT。MiRNAs在腫瘤干細胞樣細胞和腫瘤細胞的EMT過程中均發(fā)揮著重要作用,其復雜而龐大的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡是目前研究的熱點,然而,其中仍有很多疑問亟待探討:如腫瘤干細胞樣細胞本身是否會發(fā)生EMT?發(fā)生EMT的腫瘤干細胞樣細胞是否是腫瘤侵襲、轉移的根本原因?其過程是否受到miRNAs的調(diào)控?其機制如何,能否指導臨床實踐?本課題將圍繞上述問題展開研究。研究目的1.誘導肺腺癌干細胞樣細胞發(fā)生EMT。2.篩選出肺腺癌干細胞發(fā)生EMT前后差異表達的mi RNAs。3.驗證差異表達的miRNA調(diào)控肺腺癌干細胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學行為變化并探討其具體機制。研究方法一、誘導肺腺癌干細胞樣細胞發(fā)生EMT1.對普通肺腺癌細胞A549進行無血清懸浮培養(yǎng),誘導出富集成球的肺癌干細胞。2.利用流式細胞分選(FACS)篩選出CD133+/CD326+細胞,并利用裸鼠成瘤、定量PCR檢測CD133、CD326、OCT-4和Nanog的表達和激光共聚焦技術(Confocal laser scanning microscope,CLSM)對其干性表達進行鑒定。3.TGF-β1誘導CD133+/CD326+細胞發(fā)生EMT,利用Transwell侵襲實驗和實時定量PCR技術從形態(tài)學和基因水平對其進行驗證。二、利用miRNAs芯片檢測人肺腺癌干細胞樣細胞誘導發(fā)生EMT前后miRNAs的差異表達,篩選出有意義的miRNAs。1.利用實時定量PCR miRNA芯片初步篩查檢測A549,A549+TGF-β1,CD133+/CD326+細胞和CD133+/CD326+細胞+TGF-β1 4組細胞,得到差異miRNAs表達譜。2.對差異miRNAs進行靶基因預測及功能分析,構建miRNA-gene-network調(diào)控網(wǎng)絡圖譜,篩選出有意義的目標miRNAs基因,并利用實時定量PCR技術對結果進行重新驗證。三、驗證miR-181b-5p調(diào)控肺腺癌干細胞樣細胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學行為變化并探討其具體機制1.mi R-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir構建。Agomir和antagomir轉染A549和CD133+/CD326+細胞,實時定量PCR檢測miR-181b-5p表達情況。2.實時定量PCR及Western blot檢測E-cadherin表達。3.Transwell實驗檢測轉染前后細胞侵襲能力改變,裸鼠轉移瘤實驗驗證agomir轉染后腫瘤轉移灶形成能力。4.比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達情況。研究結果1.成功建立肺腺癌干細胞樣細胞EMT模型通過對普通A549細胞進行無血清懸浮培養(yǎng),成功誘導出大量致密成球的肺腺癌干細胞樣細胞球,并利用流式細胞分選技術進一步篩選出CD133+/CD326+細胞。干性鑒定實驗證明CD133+/CD326+細胞具有干細胞特性,符合進一步實驗標準。利用TGF-β1對收集的CD133+/CD326+細胞進行EMT誘導,其形態(tài)發(fā)生了明顯的類間質變化,且實時定量PCR檢測EMT相關基因發(fā)生明顯正向改變,Transwell侵襲實驗證實細胞的侵襲轉移能力得到提升。因此,我們確認已經(jīng)成功建立肺腺癌干細胞樣細胞EMT模型。2.篩選出肺腺癌干細胞樣細胞EMT相關基因miR-181b-5p利用實時定量PCR miRNA芯片對A549,A549+TGF-β1,CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1 4組細胞進行組間miRNAs的差異表達,得到差異miRNAs表達譜。對差異miRNAs進行維恩圖分析,找到特異與共有的差異mi RNAs進行后續(xù)分析。通過Targetscan和miRanda數(shù)據(jù)庫進行靶向基因預測并計算結合分值和結合位點。對靶基因根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫進行顯著性Pathway分析,找到miRNA靶基因所參與的信號轉導通路。以mi RNAs與基因之間的關系,構建相互作用網(wǎng)絡,找到網(wǎng)絡中核心調(diào)控能力的miRNAs和受miRNAs調(diào)控影響最大的基因。利用實時定量PCR技術對篩選出來的miRNAs進行驗證,提示只有miR-181b-5p的表達趨勢符合芯片數(shù)據(jù)和實驗設計,且miR-181b-5p在A549及腫瘤干細胞樣細胞誘導EMT過程中均高表達。因此,mi R-181b-5p是下一步研究的目標分子。3.miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達,促進肺腺癌干細胞樣細胞發(fā)生EMT并促進腫瘤轉移構建mi R-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir并轉染到A549和CD133+/CD326+細胞,實時定量PCR檢測miR-181b-5p表達,結果顯示agomir和antagomir分別促進和抑制miR-181b-5p的表達。Transwell實驗檢測轉染前后細胞侵襲能力改變,結果提示轉染agomir后A549、A549+TGF-β1、CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1這4組細胞的侵襲能力均得到增強;而轉染antagomir后其侵襲能力得到不同程度的下降。說明miR-181b-5p表達量與細胞的侵襲能力成正相關。通過實時定量PCR技術檢測轉染agomir和antagomir前后細胞的EMT相關基因表達情況,發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因的表達趨勢與miR-181b-5p表達量呈相反趨勢,miR-181b-5p過表達顯著抑制E-cadherin表達;Western blot檢測E-cadherin蛋白的表達情況進一步確認上述結論,提示E-cadherin基因可能是miR-181b-5p的下游靶基因。通過向裸鼠移植瘤定期注射agomir的方法,我們可以看到注射agomir后的裸鼠發(fā)生腫瘤轉移的情況明顯增多。進一步比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達情況,結果顯示腫瘤患者的外周血中miR-181b-5p表達普遍升高。研究結論miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達,促進肺腺癌干細胞樣細胞EMT形成過程,增強了癌細胞侵襲轉移能力,促進裸鼠轉移瘤的形成,初步臨床實驗也顯示mi R-181b-5p與肺癌淋巴結轉移相關,并在腫瘤患者外周血中高表達。因此,mi R-181b-5p對肺癌診斷和分期具有進一步研究和應用的重要價值。
【圖文】：

圖 1 腫瘤干細胞轉移假說示意圖（引自 Adrian, et al. Cancer Metastasis Rev. 2012）近年來，隨著在人類中數(shù)目約為 2588 個（2014 年 6 月，miRBase 21.0）調(diào)控性非編碼小分子 RNA（microRNAs，miRNAs）的逐步發(fā)現(xiàn)，為該領域的研究帶來新的希望。MiRNAs 是一類約 19～22nt 的小分子沒有具體蛋白編碼作用的單鏈 RNA，，其編碼基因位于用來翻譯蛋白質的遺傳基因中間，通過一系列的剪切，由初始的 miRNA轉變成成熟的 miRNA，并與目標 mRNA 的 3'非翻譯區(qū)基因完全或不完全互補配對，抑制蛋白質翻譯過程[14]�，F(xiàn)已明確，miRNAs 介導的信號通路是干細胞維持干性(stemness)的基礎，miRNA對胚胎干細胞或成體干細胞的自我更新、分化和增殖具有重要的調(diào)控性作用。在不同發(fā)育階段、分化進程中出現(xiàn)特定的 miRNAs，能決定細胞的分化方向以及分化時相。據(jù)估計，miRNAs 大約調(diào)控著人類全基因組中三分之一的基因[15]。與此同時，microRNAs 表達和很多的癌癥有關系，差不多為 50%的 microRNA 在遺傳位點上位置

第三軍醫(yī)大學博士學位論文源進行鑒定，與傳統(tǒng)的病理分類方法相比具有無可比擬的精細程度，僅僅依靠數(shù)百條miRNAs 分子，可望完成幾萬個 mRNA 或蛋白分子也不能完成的腫瘤分子分型[16]。MiRNAs 參與腫瘤轉移越來越多地得到證實，許多 miRNA 參與癌細胞擴散過程的調(diào)控，通過同時作用多條信號通路并靶向不同目標基因蛋白而對癌細胞擴散起激活或抑制的功能（圖 2）。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2563335