【摘要】：研究背景目前,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病率約占全部肺部腫瘤發(fā)生率的80%-85%,是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的腫瘤疾病。盡管最近10年,我們在肺癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制的研究方面取得了長足的進(jìn)步,并采取了包括手術(shù)切除、傳統(tǒng)化療、放療、分子靶向治療及免疫治療等綜合治療手段,但是患者的5年生存率依然沒有明顯的改善,只有15.9%的肺癌患者能存活5年以上,絕大多數(shù)患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。目前學(xué)術(shù)界普遍接受腫瘤干細(xì)胞假說:在惡性腫瘤組織中存在著具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞亞群,即腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancer stem-like cells,CSLCs)或稱腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cells,TICs),其不僅具有自我更新和多向分化的能力,而且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及放化療抵抗密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的存在已經(jīng)在造血系統(tǒng)腫瘤及肺癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質(zhì)瘤等多種實體惡性腫瘤的研究中得到了證實。目前多通過無血清懸浮培養(yǎng)成球富集技術(shù)或者利用細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞分選,對腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行分離與鑒定。研究顯示,肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物主要包括:CD133+、CD326+、CD44+、CD166+、ALDH1A1+、Sca1+/CD34+(小鼠),等。這些表面標(biāo)志物單獨(dú)或者共表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面,作為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的識別分子,為以腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞為靶細(xì)胞的根治性研究提供了突破口。上皮細(xì)胞間質(zhì)樣改變(EMT)是指細(xì)胞形態(tài)從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程。大量研究發(fā)現(xiàn),EMT不僅參與胚胎發(fā)育、器官纖維化,并且在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著重要作用。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中,原來在上皮細(xì)胞表面表達(dá)的標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)減少,反而間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物如波形蛋白(vimentin)、N型鈣粘蛋白(N-cadherin)等表達(dá)上調(diào),細(xì)胞失去極性,細(xì)胞間的連接變得疏松,胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組,細(xì)胞的運(yùn)動能力增加,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。EMT的過程受Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Notch等多種信號通路的調(diào)節(jié)。近年來的研究表明,microRNAs(mi RNAs)也參與腫瘤EMT過程。miRNAs是一類長約19~22個核苷酸(nt)的非編碼單鏈小分子RNA。大量的研究證實,miRNAs通過誘導(dǎo)目的mRNA降解或抑制其翻譯蛋白,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控該基因表達(dá),發(fā)揮著類似癌基因與抑癌基因的角色,顯示其作為腫瘤標(biāo)志物、預(yù)后判斷、療效監(jiān)測以及腫瘤靶向治療新靶點的廣闊應(yīng)用前景。目前有研究表明,mi RNAs也參與到腫瘤EMT過程中的各個環(huán)節(jié),miR-200家族通過調(diào)控ZEB基因的表達(dá)在抑制腫瘤EMT過程中起重要作用;而miR-214通過PI3K/AKT通路可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。MiRNAs在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的EMT過程中均發(fā)揮著重要作用,其復(fù)雜而龐大的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)是目前研究的熱點,然而,其中仍有很多疑問亟待探討:如腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞本身是否會發(fā)生EMT?發(fā)生EMT的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞是否是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的根本原因?其過程是否受到miRNAs的調(diào)控?其機(jī)制如何,能否指導(dǎo)臨床實踐?本課題將圍繞上述問題展開研究。研究目的1.誘導(dǎo)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)生EMT。2.篩選出肺腺癌干細(xì)胞發(fā)生EMT前后差異表達(dá)的mi RNAs。3.驗證差異表達(dá)的miRNA調(diào)控肺腺癌干細(xì)胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學(xué)行為變化并探討其具體機(jī)制。研究方法一、誘導(dǎo)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)生EMT1.對普通肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng),誘導(dǎo)出富集成球的肺癌干細(xì)胞。2.利用流式細(xì)胞分選(FACS)篩選出CD133+/CD326+細(xì)胞,并利用裸鼠成瘤、定量PCR檢測CD133、CD326、OCT-4和Nanog的表達(dá)和激光共聚焦技術(shù)(Confocal laser scanning microscope,CLSM)對其干性表達(dá)進(jìn)行鑒定。3.TGF-β1誘導(dǎo)CD133+/CD326+細(xì)胞發(fā)生EMT,利用Transwell侵襲實驗和實時定量PCR技術(shù)從形態(tài)學(xué)和基因水平對其進(jìn)行驗證。二、利用miRNAs芯片檢測人肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生EMT前后miRNAs的差異表達(dá),篩選出有意義的miRNAs。1.利用實時定量PCR miRNA芯片初步篩查檢測A549,A549+TGF-β1,CD133+/CD326+細(xì)胞和CD133+/CD326+細(xì)胞+TGF-β1 4組細(xì)胞,得到差異miRNAs表達(dá)譜。2.對差異miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測及功能分析,構(gòu)建miRNA-gene-network調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜,篩選出有意義的目標(biāo)miRNAs基因,并利用實時定量PCR技術(shù)對結(jié)果進(jìn)行重新驗證。三、驗證miR-181b-5p調(diào)控肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學(xué)行為變化并探討其具體機(jī)制1.mi R-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir構(gòu)建。Agomir和antagomir轉(zhuǎn)染A549和CD133+/CD326+細(xì)胞,實時定量PCR檢測miR-181b-5p表達(dá)情況。2.實時定量PCR及Western blot檢測E-cadherin表達(dá)。3.Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力改變,裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實驗驗證agomir轉(zhuǎn)染后腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成能力。4.比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達(dá)情況。研究結(jié)果1.成功建立肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT模型通過對普通A549細(xì)胞進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng),成功誘導(dǎo)出大量致密成球的肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞球,并利用流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)一步篩選出CD133+/CD326+細(xì)胞。干性鑒定實驗證明CD133+/CD326+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,符合進(jìn)一步實驗標(biāo)準(zhǔn)。利用TGF-β1對收集的CD133+/CD326+細(xì)胞進(jìn)行EMT誘導(dǎo),其形態(tài)發(fā)生了明顯的類間質(zhì)變化,且實時定量PCR檢測EMT相關(guān)基因發(fā)生明顯正向改變,Transwell侵襲實驗證實細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力得到提升。因此,我們確認(rèn)已經(jīng)成功建立肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT模型。2.篩選出肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT相關(guān)基因miR-181b-5p利用實時定量PCR miRNA芯片對A549,A549+TGF-β1,CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1 4組細(xì)胞進(jìn)行組間miRNAs的差異表達(dá),得到差異miRNAs表達(dá)譜。對差異miRNAs進(jìn)行維恩圖分析,找到特異與共有的差異mi RNAs進(jìn)行后續(xù)分析。通過Targetscan和miRanda數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶向基因預(yù)測并計算結(jié)合分值和結(jié)合位點。對靶基因根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行顯著性Pathway分析,找到miRNA靶基因所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。以mi RNAs與基因之間的關(guān)系,構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò),找到網(wǎng)絡(luò)中核心調(diào)控能力的miRNAs和受miRNAs調(diào)控影響最大的基因。利用實時定量PCR技術(shù)對篩選出來的miRNAs進(jìn)行驗證,提示只有miR-181b-5p的表達(dá)趨勢符合芯片數(shù)據(jù)和實驗設(shè)計,且miR-181b-5p在A549及腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)EMT過程中均高表達(dá)。因此,mi R-181b-5p是下一步研究的目標(biāo)分子。3.miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達(dá),促進(jìn)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移構(gòu)建mi R-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir并轉(zhuǎn)染到A549和CD133+/CD326+細(xì)胞,實時定量PCR檢測miR-181b-5p表達(dá),結(jié)果顯示agomir和antagomir分別促進(jìn)和抑制miR-181b-5p的表達(dá)。Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力改變,結(jié)果提示轉(zhuǎn)染agomir后A549、A549+TGF-β1、CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1這4組細(xì)胞的侵襲能力均得到增強(qiáng);而轉(zhuǎn)染antagomir后其侵襲能力得到不同程度的下降。說明miR-181b-5p表達(dá)量與細(xì)胞的侵襲能力成正相關(guān)。通過實時定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染agomir和antagomir前后細(xì)胞的EMT相關(guān)基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因的表達(dá)趨勢與miR-181b-5p表達(dá)量呈相反趨勢,miR-181b-5p過表達(dá)顯著抑制E-cadherin表達(dá);Western blot檢測E-cadherin蛋白的表達(dá)情況進(jìn)一步確認(rèn)上述結(jié)論,提示E-cadherin基因可能是miR-181b-5p的下游靶基因。通過向裸鼠移植瘤定期注射agomir的方法,我們可以看到注射agomir后的裸鼠發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的情況明顯增多。進(jìn)一步比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達(dá)情況,結(jié)果顯示腫瘤患者的外周血中miR-181b-5p表達(dá)普遍升高。研究結(jié)論miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達(dá),促進(jìn)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT形成過程,增強(qiáng)了癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,促進(jìn)裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的形成,初步臨床實驗也顯示mi R-181b-5p與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),并在腫瘤患者外周血中高表達(dá)。因此,mi R-181b-5p對肺癌診斷和分期具有進(jìn)一步研究和應(yīng)用的重要價值。
【圖文】：

圖 1 腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移假說示意圖（引自 Adrian, et al. Cancer Metastasis Rev. 2012）近年來，隨著在人類中數(shù)目約為 2588 個（2014 年 6 月，miRBase 21.0）調(diào)控性非編碼小分子 RNA（microRNAs，miRNAs）的逐步發(fā)現(xiàn)，為該領(lǐng)域的研究帶來新的希望。MiRNAs 是一類約 19～22nt 的小分子沒有具體蛋白編碼作用的單鏈 RNA，，其編碼基因位于用來翻譯蛋白質(zhì)的遺傳基因中間，通過一系列的剪切，由初始的 miRNA轉(zhuǎn)變成成熟的 miRNA，并與目標(biāo) mRNA 的 3'非翻譯區(qū)基因完全或不完全互補(bǔ)配對，抑制蛋白質(zhì)翻譯過程[14]�，F(xiàn)已明確，miRNAs 介導(dǎo)的信號通路是干細(xì)胞維持干性(stemness)的基礎(chǔ)，miRNA對胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的自我更新、分化和增殖具有重要的調(diào)控性作用。在不同發(fā)育階段、分化進(jìn)程中出現(xiàn)特定的 miRNAs，能決定細(xì)胞的分化方向以及分化時相。據(jù)估計，miRNAs 大約調(diào)控著人類全基因組中三分之一的基因[15]。與此同時，microRNAs 表達(dá)和很多的癌癥有關(guān)系，差不多為 50%的 microRNA 在遺傳位點上位置

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文源進(jìn)行鑒定，與傳統(tǒng)的病理分類方法相比具有無可比擬的精細(xì)程度，僅僅依靠數(shù)百條miRNAs 分子，可望完成幾萬個 mRNA 或蛋白分子也不能完成的腫瘤分子分型[16]。MiRNAs 參與腫瘤轉(zhuǎn)移越來越多地得到證實，許多 miRNA 參與癌細(xì)胞擴(kuò)散過程的調(diào)控，通過同時作用多條信號通路并靶向不同目標(biāo)基因蛋白而對癌細(xì)胞擴(kuò)散起激活或抑制的功能（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2563335