【摘要】：研究背景與目的2011年,世界范圍內(nèi)新增食管鱗癌(Esophageal squamous cell cancer, ESCC)患者約482,000例,其中超過半數(shù)ESCC病例發(fā)生在中國。近數(shù)十年,ESCC的發(fā)病率在全球內(nèi)呈下降趨勢,但是東北亞(尤其是中國)仍是ESCC高發(fā)區(qū),并且ESCC發(fā)病年齡日趨年輕。半個世紀(jì)以來,腫瘤早期診斷技術(shù)及腫瘤綜合治療方案不斷改進,但ESCC患者5年總體生存率仍徘徊在20%-30%。化療是ESCC治療的重要組成部分。以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是ESCC標(biāo)準(zhǔn)方案。ESCC具有遺傳變異及腫瘤異質(zhì)性,順鉑對ESCC患者的化療療效存在顯著的個體差異性,其臨床反應(yīng)率僅為60%。臨床亟待探索ESCC高效治療策略。其中生物學(xué)及基因治療是ESCC的研究熱點。近年來,許多研究表明ESCC是多因素誘發(fā),多步驟參與和多基因改變的全身性惡性疾病。數(shù)十年來,在食管鱗癌尚未發(fā)現(xiàn)特異、高效的靶向治療基因。ESCC的基因治療進展緩慢。其最大的障礙就是基因靶點的選擇。內(nèi)源性和外源性DNA損傷在ESCC發(fā)生和進展過程中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞DNA雙鏈斷裂是最危險的DNA損傷形式(double strand break, DSB)。DSB有兩種修復(fù)方式：DNA同源重組修復(fù)(homologous recombination repair, HRR)和DNA非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ),兩種修復(fù)方式差異巨大,但功能互補。在簡單的真核生物(酵母菌)主要依靠HR修復(fù)DSB；而復(fù)雜高等生物主要依靠NHEJ。Ku蛋白是NHEJ途徑早期應(yīng)答蛋白。Ku蛋白異�？梢饳C體DSB修復(fù)障礙,DNA不穩(wěn)定,癌癥傾向及免疫異常。Ku蛋白是Ku70與Ku80形成的異二聚體。Ku70基因與LO℃389901基因,又稱X線修復(fù)交叉互補基因6假基因2 (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6 pseudogene 2)高度同源,靶向沉默或者過表達Ku70可能影響LOC389901基因。Ku80蛋白除了參與DSB NHEJ途徑外,還具有更重要的功能：維持染色體端粒穩(wěn)定、參與免疫球蛋白編碼基因V(D)J鏈重排,調(diào)節(jié)細(xì)胞增值、凋亡、下游基因表達及信號傳導(dǎo)。并且,Ku80在多種人類實體腫瘤內(nèi)異常轉(zhuǎn)錄,與結(jié)腸、肝、乳腺及肺的惡性腫瘤進展相關(guān)。因此,本研究以Ku80為目標(biāo)基因。我們前期研究表明：Ku80在ESCC高表達并與其惡性進展相關(guān)。然而,Ku80表達水平對ESCC順鉑化療敏感性的影響尚不明確,Ku80基因在ESCC的分子生物學(xué)功能仍需進一步探索。本研究分別從基因和蛋白水平檢測Ku80在ESCC組織中的表達,探討臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。應(yīng)用RNA干擾沉默Ku80,探索在ESCC的分子生物學(xué)功能；通過細(xì)胞培養(yǎng)探究Ku80對ESCC體外順鉑敏感性的作用。建立ESCC病人源性免疫缺陷小鼠移植瘤(preclinical patient-derived esophageal squamous cell carcinoma xenograft, PDECX)模型,利用PDECX模型檢測局部注射慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA, shRNA)沉默Ku80對ESCC體內(nèi)生長的作用；并探索沉默Ku80逆轉(zhuǎn)ESCC順鉑化療耐藥的體內(nèi)效果。本研究旨在于評價Ku80作為ESCC靶基因的意義,為ESCC治療開拓新思路。第一部分 Ku80在食管鱗癌組織的表達及臨床意義目的1.探討Ku80在ESCC組織中的表達變化。2.研究ESCC組織Ku80表達水平與臨床病理學(xué)特點及預(yù)后的相關(guān)性。方法1.選取從2003年1月到2003年6月山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院住院治療的119例ESCC患者,建立ESCC臨床資料庫。同時選取109例行胃鏡檢查的單純胃炎患者作為陰性照組,建立陰性對照組臨床資料庫。另篩選從2000年2月至2004年2月于山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院胸外科行Ivor-Lewis手術(shù)的217例胸中段pT2NOMO期ESCC患者,建立pT2NOMO期ESCC臨床資料庫。食管癌患者收集ESCC組織和癌旁正常食管黏膜(corresponding healthy mucosa, CHEM);陰性對照組收集其正常食管黏膜(normal esophageal mucosa, NEM),建立臨床組織標(biāo)本庫。2.應(yīng)用RT-PCR和免疫組化染色檢測119例ESCC患者及109例對照組食管黏膜中Ku80 mRNA及蛋白表達水平；應(yīng)用免疫組化染色及Western blotting檢測217例pT2N0M0患者ESCC組織Ku80蛋白表達差異。3.受試者特征曲線(receiver operating characteristics curve, ROC)分析,確定Ku80差異性表達的臨界值(cut-off value), Kaplan-Meier繪制生存曲線,Log-rank生存分析。應(yīng)用Cox風(fēng)險模型,多因素分析ESCC患者生存獨立危險因素。結(jié)果1.119例食管癌患者ESCC組織內(nèi)Ku80 mRNA (5.348 ± 1.480)表達水平顯著高于遠端CHEM (3.327±1.106)及109例陰性對照組NEM (3.149±1.092) (ANOVA; P0.001,P0.001)。ROC曲線分析顯示：Ku80 mRNA表達臨界值為4.35時具有最大敏感性(74.8%)及特異性(87.2%),曲線下面積(area under the ROC curve, AUC)為0.878(95%CI,0.829-0.918)。119例食管癌患者ESCC組織內(nèi)Ku80免疫組化評分(9.656±4.633)顯著高于遠端CHEM (5.608±3.759)及109例陰性對照組NEM(5.532±3.741) (Mann-Whitney U test; P0.001,P0.001)。ROC曲線分析顯示：Ku80免疫組化評分為9時具有最大敏感性(67.0%)及特異性(87.2%)。2.217例胸中段pT2N0M0期食管癌患者ESCC的Ku80免疫組化評分顯著高于CHEM (Mann-Whitney U test; P0.001)。Western blotting結(jié)果示ESCC內(nèi)Ku80蛋白表達(0.907±0.086)比CHEM (0.364±0.052)顯著增高(t test; P=0.001)。ROC曲線分析顯示：Ku80閾值為9時具有最大敏感性(67.9%)及特異性(85.1%),AUC為0.866(95%CI,0.807-0.912)。3.卡方分析顯示119例ESCC患者的Ku80 mRNA的表達與腫瘤分化(P=0.016),局部浸潤(P=0.016),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)和TNM分期(P=0.001)相關(guān)；Ku80蛋白表達與腫瘤分化(P=0.001),局部浸潤(P=0.004),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)和腫瘤分期(P=0.002)相關(guān)。217例pT2N0M0期ESCC患者的Ku80與腫瘤大小(P=0.018),分化程度(P=0.010),和TNM分期(P=0.001)密切相關(guān)。4.119例ESCC患者Cox多因素生存分析示：局部浸潤(P=0.011),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009), TNM分期(P0.001), Ku80 mRNA表達水平和蛋白水平(P=0.024,P=0.007)是總體生存(overall survival, OS)的獨立預(yù)后因素。217例pT2N0M0期ESCCCox比例風(fēng)險模型顯示：腫瘤局部浸潤,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,TNM分期,Ku80蛋白表達水平是OS和無病生存(disease-free survival, DFS)的獨立預(yù)后影響因素。結(jié)論1.與正常食管黏膜及癌旁組織相比,Ku80在ESCC異常高表達。2. Ku80 mRNA及蛋白表達水平與ESCC患者的惡性臨床病理學(xué)特點密切相關(guān)。3. Ku80 mRNA及蛋白水平可以評估ESCC的生存,是預(yù)后的獨立危險因素。第二部分 靶向沉默Ku80對ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為及順鉑體外化療敏感性的作用目的1.研究Ku80基因在ESCC的生物學(xué)功能。2.明確特異性沉默Ku80對ESCC體外順鉑化療敏感性的影響。方法1.體外培養(yǎng)293T感受態(tài)細(xì)胞,ESCC細(xì)胞系ECA109和KYSE150; LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌菌株DH5α；無特定病原體(specific pathogen free, SPF)條件飼養(yǎng)BALB/ cNude鼠。2. Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫檢索Ku80(NM_021141)的基因序列,設(shè)計并篩選多個siKNA干擾靶點序列及scramble序列。合成DNA oiigo并與線性化載體連接,經(jīng)大腸桿菌菌株DH5a轉(zhuǎn)化,293T感受態(tài)細(xì)胞病毒包裝及病毒滴度測定后,構(gòu)建GV115慢病毒介導(dǎo)的shRNAKu80,3.根據(jù)細(xì)胞感染倍數(shù)(multiplicity of infection, MOI)值,將GV115慢病毒介導(dǎo)的shRNA載體及scramble載體轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞系ECA109和KYSE150o經(jīng)連續(xù)培養(yǎng),篩選成功轉(zhuǎn)染ECA109和KYSE150細(xì)胞。4.應(yīng)用RT-PCR及Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后ECA109和KYSE150細(xì)胞的Ku80mRNA及蛋白表達水平,驗證Ku80沉默效率并篩選效果最好的shRNAo5.CCK-8檢測ECA109和KYSE150細(xì)胞增值活力,并繪制細(xì)胞生長曲線。集落形成實驗探討ECA109和KYSE150集落形成能力變化。細(xì)胞劃痕及transwell實驗檢測細(xì)胞運動,遷移及侵襲能力改變。流式細(xì)胞儀探討ECA109和KYSE150細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化。BALB/c裸鼠種植實驗檢測ECA109和KYSE150成瘤能力。6.配制順鉑梯度濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基,培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前后ECA109和KYSE150細(xì)胞,檢測ESCC細(xì)胞體外順鉑化療敏感性變化。7.采用SPSS統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù),數(shù)值變量多組比較用ANOVA分析方法,數(shù)值變量兩個獨立組分析采用t檢驗。P0.05定義為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.篩選3個具有最佳動力學(xué)參數(shù)的siRNA序列,成功制備GV115慢病毒介導(dǎo)的shRNA載體：shRNA1,shRNA2和shRNA3;根據(jù)scramble序列,構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的scramble為陰性對照。GV115慢病毒介導(dǎo)的shRNA載體感染ECA109和KYSE150細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好,感染率90%。2. RT-PCR結(jié)果顯示：未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的ECA109細(xì)胞Ku80 mRNA相對表達量分別為1,0.912±0.061,0.584±0.038,0.429±0.027,0.112±0.015；未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的KYSE150細(xì)胞的Ku80 mRNA相對表達量分別為1,0.923±0.071,0.596±0.047,0.445±0.037,0.173±0.025。shRNA-3感染ECA109和KYSE150細(xì)胞的Ku80 mRNA表達量最少,相比于shRNA-scramble感染細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)差異(ANOVA; P0.001, P0.001)。3. Western blotting結(jié)果顯示：未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的ECA109細(xì)胞Ku80蛋白相對表達量分別為0.845±0.088,0.713±0.083,0.427±0.053,0.316±0.041,0.198±0.03；未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的KYSE150細(xì)胞的Ku80蛋白相對表達量分別為0.823±0.091,0.745±0.069,0.448±0.053,0.326±0.047,0.182 ■ 0.027o shRNA-3感染ECA109和KYSE150細(xì)胞的Ku80蛋白表達量最少,相比于shRNA-scramble感染細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)差異(ANOVA; P0.001, P0.001)。因此,選擇shRNA-3為shRNA Ku80并進行下步功能學(xué)實驗。4.CCK-8結(jié)果顯示shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150增值速度比shRNA scramble感染細(xì)胞明顯下降；而shRNA scramble感染ECA109和KYSE150與未感染細(xì)胞的增值速度無明顯差異,說明Ku80沉默對ECA109和KYSE150增殖活力有顯著抑制作用。5.未感染,shRNA scramble感染,shRNA Ku80感染的ECA109形成的克隆數(shù)目分別為481±43,398±45,187±32。未感染,shRNA scramble感染,shRNAKu80感染的KYSE150形成的克隆數(shù)目分別為543±52,406±47,224±38。未感染ECA109和KYSE150與shRNA scramble感染組無顯著差異,與shRNAKu80感染細(xì)胞有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(ANOVA; P0.001, P0.001)。6.劃痕實驗證明shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150運動至劃痕處細(xì)胞數(shù)相比于未感染細(xì)胞顯著下降(ANOVA; P0.001, P0.001), shRNA scramble感染組未有顯著變化。Transwell實驗證實,shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150細(xì)胞的遷移和侵襲能力均較未感染細(xì)胞有明顯降低,而shRNA scramble感染細(xì)胞未有明顯改變。7.流式細(xì)胞術(shù)證實shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150凋亡率顯著增加,而shRNA scramble感染細(xì)胞無顯著增加。shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150細(xì)胞相比于未感染細(xì)胞G2/M期比例增加,G1/G0期比例降低(X square; P0.001, P0.001)。shRNA scramble感染細(xì)胞周期無顯著改變。8. BALB/c裸鼠種植實驗表明：shRNA Ku80組,shRNA scramble組和空白對照組平均ECA109細(xì)胞移植瘤體積分別為3923±418 mm3,3462±357 mm3,923±89 mm3。shRNA Ku80組, shRNA scramble組和空白對照組平均KYSE150細(xì)胞移植瘤體積分別為3698±384 mm3,3395±341 mm3,846±74 mm3. shRNA Ku80 ECA109及KYSE150細(xì)胞種植瘤顯著低于對照組種植瘤(ANOVA; P0.001, P0.001)。9.濃度梯度順鉑體外化療檢測結(jié)果顯示：順鉑對未感染,shRNA scramble感染,shRNA Ku80感染ECA109細(xì)胞的IC50為85.97μg/ml,79.49μg/ml,8.22μg/ml。順鉑對未感染,shRNA scramble感染,shRNA Ku80感染KYSE150細(xì)胞的IC50為75.45μg/ml,72.40μg/ml,9.59μg/ml。與未感染細(xì)胞相比,shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150對順鉑體外化療敏感性顯著增強。結(jié)論1.靶向Ku80沉默顯著抑制ESCC增值,克隆形成,運動,遷移,侵襲及種植瘤體內(nèi)生長。2.Ku80基因沉默促進ESCC細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞周期。3.靶向沉默Ku80基因提高ESCC細(xì)胞對順鉑體外化療的敏感性。第三部分 建立PDECX模型,評估靶向沉默Ku80對ESCC順鉑體內(nèi)化療敏感性的作用目的1.建立PDECX模型,評估局部注射慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默Ku80的體內(nèi)效果。2.以PDECX模型為實驗平臺,探索沉默Ku80對ESCC順鉑體內(nèi)化療敏感性的作用。方法1.于2014年3月至2014年7月連續(xù)收集山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科行食管鱗癌切除術(shù)的患者,收集新鮮ESCC組織。經(jīng)RT-PCR檢測,選取Ku80 mRNA高表達ESCC組織碎塊分別種植至BALB/c裸鼠皮下。并經(jīng)過三代鼠-鼠連續(xù)傳代種植,建立PDECX模型。2. PDECX模型隨機分為3組。shRNA Ku80實驗組：瘤體多部位局部注射GV115慢病毒介導(dǎo)的shRNA Ku80; scramble對照組：瘤體多部位局部注射GV115慢病毒介導(dǎo)的shRNA scramble;空白對照組：瘤體多部位局部注射polybrene(E)。3. PDECX模型成瘤5周后,給予BALB/c裸鼠順鉑注射液,測量腫瘤生長體積. PDECX模型生長8周后取出,測量腫瘤濕量及體積,檢測順鉑體內(nèi)化療敏感性。4. RT-PCR,免疫組化染色及Western blotting實驗評估PDECX模型Ku80體內(nèi)特異性沉默效果。結(jié)果1.選取Ku80 mRNA高表達98例新鮮ESCC組織種植于BALB/c裸鼠成瘤93例,第一代鼠-鼠傳代成瘤53例,第二代成瘤48例,第三代成瘤45例。經(jīng)連續(xù)三代鼠-鼠連續(xù)傳代種植后,成功建立PDECX模型45例隨機分3組,shRNA Ku80實驗組,scramble對照組,空白對照組各15例。2. RT-PCR顯示shRNA Ku80實驗組,scramble對照組,空白對照組PDECX瘤體組織Ku80 mRNA相對表達量為0.254±0.028,0.876±0.057,0.903±0.061。免疫組化染色顯示空白對照組及scramble對照組瘤體組織Ku80高表達,呈細(xì)胞核顆粒性黃染。shRNA Ku80實驗組瘤體組織Ku80細(xì)胞核著色顯著減少。shRNA Ku80組,scramble組,BC組種植瘤組織Ku80蛋白相對表達量為0.268±0.019,0.793±0.054,0.912±0.071。相比于空白對照組,shRNA Ku80實驗組瘤體Ku80蛋白表達量顯著降低(ANOVA; P0.001)。3. PDECX腫瘤生長5周時,shRNA Ku80組,scramble組,BC組種植瘤體積分別為3291±156 mm3,6653±317 mm3,7247±428 mm3。繼續(xù)飼養(yǎng)3周后,shRNA Ku80組,scramble組,BC組種植瘤體積為483±72mm3,3974±189mm3,4526±247mm3。shRNA Ku80實驗組,scramble對照組,BC組PDECX腫瘤濕重分別為0.636±0.062g,3.851±0.389g,4.124±0.573g。shRNA Ku80實驗組瘤體重量顯著小于空白對照組(ANOVA; P0.001)。結(jié)論1.局部注射慢病毒介導(dǎo)shRNA能特異性沉默PDECX種植瘤組織內(nèi)Ku80表達。2.Ku80沉默顯著抑制體內(nèi)PDECX種植瘤的生長。3.特異性沉默Ku80提高PDECX腫瘤對順鉑體內(nèi)化療敏感性。
【圖文】：

－ｐｅｃｃｉｙ逡逑圖ｌ．Ｋｕ８０在１１９例ＥＳＣＣ組織中高表達。逡逑；邋ＲＴ－ＰＣ民分析ＫｕＳＯｍＲＮＡ表達水平；Ｂ：邋ＲＯＣ分析確定ＫｕＳＯｍＲＮＡ高表值；Ｃ；免疫組化染色檢測Ｋｕ８０蛋白水平；Ｄ：邋ＲＯＣ分析確定Ｋｕ８０蛋白高界值。ＥＳＣＣ：食管淲癌；ＣＨＥＭ：癌旁正常黏膜；ＮＥＭ：正常食管黏膜；ＲＯＣ：者特征曲線；ＩＨＣ：免疫組織化學(xué)染色。逡逑

邋邐邋Ｂ邋１．０－邋－ｎ邐－ｎ邋ｈｉｇｈ邋Ｋｕ８０邋ｉｎＲＮＡ邐１．護邐－Ｔｉ邋ｈｉｇ�。殄澹耍酰福板澹穑颍铮簦澹椋頝B邐－ｎｉｏｗＫｕＳＯｒａＲＮＡ邐＼＼邐－ｎ｜0ｗＫｉｉ８０邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑邋ｒ邋ｔｖ逡逑ｒ逡逑邋０４－邐１－－邐Ｖ邋ｋ逡逑邋０．２－邐＼＼邋Ｉｃ－逡逑０．０－邐Ｓ邐０．０－邐＊—Ｓ＿？邐、逡逑０邐２５邐５０邐７５邐１００邐１２３邐０邐２５邐５０邐７５邐１００邐１２５逡逑Ｔｉｍｅ邋如ｏｎｔｈｓ）邐Ｔｉｍｅ邋（ｍｏｎｔｈｓ）逡逑３．邋Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ邋分析邋１１９邋例邋ＥＳＣＣ邋患者總體生存（ｏｖｅｒａｌｌ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ，邋ＯＮＡ（Ａ）和蛋白巧）高表達患者預(yù)后較差。ＥＳＣＣ：食管淲癌（ｅｓｏｐｈａｇｓ邋ｃｅｌｌ邋ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
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本文編號：2561411