發(fā)布時(shí)間：2019-11-13 12:18

【摘要】：目的：探討RNA干擾技術(shù)靶向沉默β-catenin基因后對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、分裂周期和COX-2以及hTERT的影響。方法：利用RNA干擾技術(shù)將特異性β-catenin小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染至胃癌AGS細(xì)胞以沉默其基因表達(dá),將實(shí)驗(yàn)設(shè)置為三組,設(shè)置實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染siRNA-β-catenin的胃癌AGS細(xì)胞,陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染siRNA-control的胃癌AGS細(xì)胞,Blank組為未轉(zhuǎn)染的正常AGS細(xì)胞。使用熒光顯微鏡檢測(cè)熒光標(biāo)記片段的轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)用熒光定量-PCR檢測(cè)靶向沉默β-catenin基因的表達(dá)和沉默效率,以及hTERT和COX-2基因的表達(dá)水平；蛋白免疫印記法檢測(cè)β-catenin、hTERT和COX-2在蛋白水平的表達(dá)；MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析各組細(xì)胞周期。結(jié)果：轉(zhuǎn)染siRNA特異性片段靶向沉默β-catenin基因可明顯下調(diào)β-catenin的表達(dá)量(1.764±0.045 vs 1.00±0.043),實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；hTERT mRNA的表達(dá)水平與陰性對(duì)照組比較明顯抑制(2.37±0.022 vs 1.00±0.030),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因COX-2 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)(1.84±0.057 vs 1.00±0.038),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。沉默β-catenin基因后β-catenin, hTERT和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量受到抑制,實(shí)驗(yàn)組對(duì)比于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第3天增殖能力明顯下降(P0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默β-catenin基因72小時(shí)后可抑制細(xì)胞周期,相比于陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：抑制β-catenin基因后能降低胃癌AGS細(xì)胞的增殖能力,阻斷細(xì)胞周期和降低COX-2的表達(dá),β-catenin基因有望成為胃癌治療新靶點(diǎn)；Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參與hTERT的調(diào)控,并通過(guò)hTERT及端粒酶發(fā)揮某些生物學(xué)功能。
【圖文】：

結(jié)果當(dāng)設(shè)置ｓｉＲＮＡ：Ｔｒａｎｓｆｅｃ化ｎＲｅａｇｅｎｔ為４：邋３、轉(zhuǎn)染化時(shí)后可在巧逡逑光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)ｓｉＲＮＡ攜帶的巧光片段，與相同視野下轉(zhuǎn)換至普通顯逡逑微鏡所觀察到的活細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)比，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)８０％Ｗ上（詳見(jiàn)圖３．１）。逡逑ＩＢ逡逑普通顯岕鏡黃光顯微鏡逡逑圖３．１邋ＡＧＳ細(xì)胞轉(zhuǎn)染后檢測(cè)（２００Ｘ）逡逑Ｆｉｇ．３．１邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＧＳ邋ｃｅｌｌｓ邋比ａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋（２００邋Ｘ）逡逑３．２沉默目－ｃａｔｅｎｉｎ基因?qū)ξ赴粒牵蛹?xì)胞增殖能力的影響逡逑運(yùn)用脅Ａｉ技術(shù){南虺聊穡悖幔簦澹睿椋罨蠔�，ＭＴＴ法检诧傖果盘蕬至x希觧,Ａ－Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ組細(xì)胞的增殖能力明顯降低，與ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ姐相比在生長(zhǎng)第逡逑３天后增殖能力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（０．４９±０．０２５ｖｓ０．６５±０．０３７）；而ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ狙逡逑與Ｂｌａｎｋ組相比，細(xì)胞增殖能力無(wú)思著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（化６５±０．０３７邋ｖｓ邋０．６化化０２３）逡逑（詳見(jiàn)圖３．２）。逡逑１７逡逑

ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ邋組邋Ｇｉ邋期（５６．２３％±１．５３％）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而邋ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ邋組逡逑Ｇｉ期（５６．２３％±１．５３％）與Ｂｌａｎｋ組細(xì)胞Ｇｉ期（５５．５２％±１．５２％）相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差逡逑異（詳見(jiàn)圖３．３）。逡逑ｉ邋．邋Ｂ邋Ｉ邋ｉｒ邋ｊ邋Ｗ逡逑ＬＬＵＬＬＬ逡逑Ｂｌａｎｋ邐ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｌｒｏｌ邐ｓｉＲＮＡ－ｐ－ｃａｌｅｉｉｉｉｉ逡逑圖３．３轉(zhuǎn)染后檢測(cè)Ｓ細(xì)細(xì)胞的周期分布，，上圖分別代表了邋Ｂｌａｎｋ細(xì)、ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ組和逡逑ｓｉＲＮＡ－Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ組３組細(xì)胞的周期分布情況逡逑Ｆｉｇ．３．３邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ａｆｔｅｒ邋化ａｎｓｆｅｃｔｅｄ
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2560302