【摘要】：目的：探討RNA干擾技術(shù)靶向沉默β-catenin基因后對胃癌AGS細胞增殖、分裂周期和COX-2以及hTERT的影響。方法：利用RNA干擾技術(shù)將特異性β-catenin小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染至胃癌AGS細胞以沉默其基因表達,將實驗設(shè)置為三組,設(shè)置實驗組為轉(zhuǎn)染siRNA-β-catenin的胃癌AGS細胞,陰性對照組為轉(zhuǎn)染siRNA-control的胃癌AGS細胞,Blank組為未轉(zhuǎn)染的正常AGS細胞。使用熒光顯微鏡檢測熒光標(biāo)記片段的轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)用熒光定量-PCR檢測靶向沉默β-catenin基因的表達和沉默效率,以及hTERT和COX-2基因的表達水平；蛋白免疫印記法檢測β-catenin、hTERT和COX-2在蛋白水平的表達；MTT法檢測各組細胞增殖,流式細胞術(shù)檢測分析各組細胞周期。結(jié)果：轉(zhuǎn)染siRNA特異性片段靶向沉默β-catenin基因可明顯下調(diào)β-catenin的表達量(1.764±0.045 vs 1.00±0.043),實驗組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；hTERT mRNA的表達水平與陰性對照組比較明顯抑制(2.37±0.022 vs 1.00±0.030),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因COX-2 mRNA的表達水平下調(diào)(1.84±0.057 vs 1.00±0.038),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。沉默β-catenin基因后β-catenin, hTERT和COX-2蛋白相對表達量受到抑制,實驗組對比于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。MTT法檢測細胞在轉(zhuǎn)染后第3天增殖能力明顯下降(P0.05)；流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)沉默β-catenin基因72小時后可抑制細胞周期,相比于陰性對照組實驗組細胞周期的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：抑制β-catenin基因后能降低胃癌AGS細胞的增殖能力,阻斷細胞周期和降低COX-2的表達,β-catenin基因有望成為胃癌治療新靶點；Wnt/β-catenin信號通路可能參與hTERT的調(diào)控,并通過hTERT及端粒酶發(fā)揮某些生物學(xué)功能。
【圖文】：

結(jié)果當(dāng)設(shè)置ｓｉＲＮＡ：Ｔｒａｎｓｆｅｃ化ｎＲｅａｇｅｎｔ為４：邋３、轉(zhuǎn)染化時后可在巧逡逑光顯微鏡下觀察到細胞內(nèi)ｓｉＲＮＡ攜帶的巧光片段，與相同視野下轉(zhuǎn)換至普通顯逡逑微鏡所觀察到的活細胞計數(shù)對比，轉(zhuǎn)染效率可達８０％Ｗ上（詳見圖３．１）。逡逑ＩＢ逡逑普通顯岕鏡黃光顯微鏡逡逑圖３．１邋ＡＧＳ細胞轉(zhuǎn)染后檢測（２００Ｘ）逡逑Ｆｉｇ．３．１邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＧＳ邋ｃｅｌｌｓ邋比ａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋（２００邋Ｘ）逡逑３．２沉默目－ｃａｔｅｎｉｎ基因?qū)ξ赴粒牵蛹毎鲋衬芰Φ挠绊戝义线\用脅Ａｉ技術(shù){南虺聊穡悖幔簦澹睿椋罨蠔�，ＭＴＴ法检诧傖果盘蕬至x希觧,Ａ－Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ組細胞的增殖能力明顯降低，與ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ姐相比在生長第逡逑３天后增殖能力有統(tǒng)計學(xué)差異（０．４９±０．０２５ｖｓ０．６５±０．０３７）；而ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ狙逡逑與Ｂｌａｎｋ組相比，細胞增殖能力無思著統(tǒng)計學(xué)差異（化６５±０．０３７邋ｖｓ邋０．６化化０２３）逡逑（詳見圖３．２）。逡逑１７逡逑

ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ邋組邋Ｇｉ邋期（５６．２３％±１．５３％）相比有統(tǒng)計學(xué)差異；而邋ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ邋組逡逑Ｇｉ期（５６．２３％±１．５３％）與Ｂｌａｎｋ組細胞Ｇｉ期（５５．５２％±１．５２％）相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差逡逑異（詳見圖３．３）。逡逑ｉ邋．邋Ｂ邋Ｉ邋ｉｒ邋ｊ邋Ｗ逡逑ＬＬＵＬＬＬ逡逑Ｂｌａｎｋ邐ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｌｒｏｌ邐ｓｉＲＮＡ－ｐ－ｃａｌｅｉｉｉｉｉ逡逑圖３．３轉(zhuǎn)染后檢測Ｓ細細胞的周期分布，，上圖分別代表了邋Ｂｌａｎｋ細、ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ組和逡逑ｓｉＲＮＡ－Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ組３組細胞的周期分布情況逡逑Ｆｉｇ．３．３邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ａｆｔｅｒ邋化ａｎｓｆｅｃｔｅｄ
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：2560302