【摘要】：目的:NUPR1是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,應(yīng)激條件誘導(dǎo)其表達(dá)增加并參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期等重要過(guò)程。以往研究發(fā)現(xiàn),NUPR1參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展調(diào)控。NUPR1能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、胰腺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展等重要過(guò)程。另外,NUPR1還參與誘導(dǎo)癌細(xì)胞的早熟性衰老與凋亡,對(duì)癌癥的發(fā)展具有抑制作用。在癌癥患者中,自噬被認(rèn)為通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)參與腫瘤發(fā)展。然而,自噬的調(diào)控機(jī)制尚屬未知。NUPR1能夠參與自噬的調(diào)節(jié)已有報(bào)道。目前,NUPR1對(duì)肺癌的自噬研究少有報(bào)道。通過(guò)該項(xiàng)研究,在非小細(xì)胞肺癌細(xì)中探索NUPR1對(duì)肺癌患者生存期的關(guān)聯(lián),求證NUPR1對(duì)自噬進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制,以期對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展有更充分地認(rèn)識(shí),為肺癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。方法:本研究分為三部分。第一部分研究NUPR1在肺癌患者的表達(dá)情況;第二部分探索改變NUPR1表達(dá)后,肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的生命活動(dòng)變化;第三部分研究NUPR1對(duì)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。第一部分:通過(guò)免疫組織化學(xué)染色分析肺癌患者組織芯片中NUPR1的表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)分析NUPR1與肺癌患者生存期之間的關(guān)聯(lián)。利用RT-PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常人支氣管上皮細(xì)胞系與多種肺癌細(xì)胞中NUPR1的表達(dá)水平。第二部分:利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在肺癌細(xì)胞系中下調(diào)NUPR1的表達(dá),通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察肺癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,利用中性紅染色、吖啶橙染色、Lyso-Tracker Red染色對(duì)下調(diào)NUPR1表達(dá)的肺癌細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)改變進(jìn)行分析,通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)途徑的蛋白分子標(biāo)記物的表達(dá)水平差異,然后進(jìn)行Brd U細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成能力實(shí)驗(yàn)、小鼠皮下注射成瘤等實(shí)驗(yàn),對(duì)下調(diào)NUPR1表達(dá)的肺癌細(xì)胞所發(fā)生的生物學(xué)功能改變進(jìn)行檢測(cè)。第三部分:下調(diào)NUPR1的肺癌細(xì)胞提取總RNA,與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組對(duì)比分析,驗(yàn)證差異表達(dá)基因。通過(guò)Ch IP實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)NUPR1的直接調(diào)控基因SNAP25,然后下調(diào)SNAP25檢測(cè)細(xì)胞功能改變并通過(guò)過(guò)表達(dá)SNAP25進(jìn)行細(xì)胞功能恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)免疫沉淀質(zhì)譜分析鑒定SNAP25在維持肺癌細(xì)胞自噬功能過(guò)程中的共同作用蛋白。結(jié)果:第一部分研究結(jié)果顯示:在肺癌細(xì)胞系中NUPR1的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常人肺支氣管上皮細(xì)胞系NHBE;對(duì)肺癌組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(IHC)分析,IHC染色結(jié)果顯示,組織芯片中118例肺癌組織中NUPR1蛋白在患者肺癌組織中高表達(dá),22例癌旁對(duì)照組織中NUPR1蛋白低表達(dá);NUPR1低表達(dá)的肺癌患者生存期明顯優(yōu)于高表達(dá)NUPR1的肺癌患者(P0.01)。第二部分研究結(jié)果顯示:下調(diào)NUPR1后的A549細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量囊泡,隨著時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞大量死亡;中性紅染色、吖啶橙染色、Lyso-Tracker Red染色均為陽(yáng)性,下調(diào)NUPR1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡為酸性結(jié)構(gòu);下調(diào)NUPR1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬溶酶體外排釋放功能受損,導(dǎo)致自噬溶酶體的體積增大形成囊泡,并且囊泡在自噬缺陷的肺癌細(xì)胞中無(wú)法形成;下調(diào)NUPR1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞早熟性衰老,削弱肺癌細(xì)胞增殖能力和成克隆能力。第三部分研究結(jié)果顯示:下調(diào)NUPR1的A549細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Ρ?自噬和溶酶體途徑的諸多基因轉(zhuǎn)錄改變,例如ATG9B、LCN2、TPPP3、SNAP25和SQSTM1等;下調(diào)SNAP25誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡,誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞早熟性衰老,削弱肺癌細(xì)胞增殖能力;過(guò)表達(dá)SNAP25可部分消除NUPR1缺失引起的囊泡,進(jìn)而證實(shí)SNAP25是NUPR1的直接操控基因。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、NUPR1 在肺癌的表達(dá)1.2 結(jié)果1.2.1 NUPR1 在肺癌組織中高表達(dá)為了探索 NUPR1 對(duì)肺癌的影響，本研究首先選取正常人肺支氣管上皮細(xì)胞系 NHBE 與多種肺癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，提取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞總 RNA，，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到各細(xì)胞系的 cDNA，通過(guò) RT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NUPR1 轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異；選取以上細(xì)胞系對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞收取全細(xì)胞裂解液，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NUPR1 的蛋白表達(dá)差異。

圖 2.1 下調(diào) NUPR1 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生囊泡。A，RT-PCR 檢測(cè) shRNA下調(diào) NUPR1的效率，GAPDH為內(nèi)參基因，*P < 0.01。B，Western blot檢測(cè)shRNA下調(diào)NUPR1的效率，GAPDH 為內(nèi)參照。C，倒置光學(xué)顯微鏡觀察下調(diào) NUPR1 誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞形態(tài)改變， 比例尺 10 μm。2.2.2 下調(diào) NUPR1 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡是細(xì)胞內(nèi)的酸性結(jié)構(gòu)為了證實(shí)我們所提出的假設(shè)，我們需要對(duì)下調(diào) NUPR1 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡做進(jìn)一步研究，確認(rèn)所產(chǎn)生囊泡的屬性。首先，我們選取中性紅（Neutral red）作為染料，中性紅是一種水溶性染料，分子量為 288，能夠穿過(guò)活細(xì)胞膜并結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)的酸性膜結(jié)構(gòu)內(nèi)部，活細(xì)胞不能攝取染料，因此，染色紅色為染色陽(yáng)性結(jié)果。將中性紅染色法用于真核細(xì)胞染色研究細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)已有文獻(xiàn)報(bào)道[24,25]。本研究中應(yīng)用中性紅染色測(cè)定下調(diào) NUPR1 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡屬性，結(jié)果表明：下調(diào) NUPR1 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡是中性紅染色陽(yáng)性的結(jié)構(gòu)（圖2.2A），屬于細(xì)胞質(zhì)中的酸性結(jié)構(gòu)。然后，選擇吖啶橙（acridine orange，AO）作為鑒定囊泡屬性的第二種染色方法，吖啶橙是一種熒光染色試劑，能通過(guò)細(xì)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2544875