【摘要】：膽管癌是除肝細胞癌最常見的肝膽系統(tǒng)惡性腫瘤，手術為其主要治療方式，但僅適用于少數(shù)患者。膽管癌對化療普遍不敏感。順鉑是目前臨床指南推薦的膽管癌化療藥物，但天然或獲得性耐藥嚴重影響其療效。研究膽管癌順鉑耐藥機制具有重要意義。目前認為順鉑耐藥機制主要包括藥物濃度不足、DNA損傷修復異常和凋亡逃逸等。 線粒體是順鉑的細胞內作用靶點之一，且線粒體凋亡途徑是順鉑發(fā)揮抗腫瘤作用的主要途徑之一。Bcl-2家族蛋白是通過調節(jié)細胞內抗凋亡家族成員與促凋亡家族成員的平衡影響線粒體外膜通透性形成，調節(jié)線粒體凋亡途徑。在其他腫瘤中，Bcl-2家族蛋白已被證實與順鉑耐藥機制密切相關。然而目前關于膽管癌順鉑耐藥的機制研究較少。一些研究提示Bcl-2家族抗凋亡蛋白可能介導膽管癌耐受順鉑。 Bcl-2家族除調控線粒體外膜通透性外，也參與調節(jié)線粒體動力學。線粒體動力學主要指線粒體總量、線粒體間連接、線粒體亞細胞定位的動態(tài)變化,主要涉及線粒體分裂融合和線粒體自噬兩個過程。目前認為線粒體動力學和細胞凋亡有關。線粒體通過分裂和融合產生短線粒體和長線粒體。線粒體分裂通常有利于哺乳動物中線粒體外膜通透性形成，而線粒體融合則會降低細胞對凋亡的敏感性。一些學者懷疑線粒體融合是順鉑耐藥的潛在機制。目前公認線粒體分裂是線粒體自噬發(fā)生的前提。線粒體自噬是一種特殊形式的自噬。它在化療耐藥中的作用尚不明確。過度線粒體自噬可以導致細胞死亡。線粒體融合可抑制線粒體自噬發(fā)生，從而可能干擾線粒體自噬性細胞死亡。因此線粒體自噬也可能參與膽管癌順鉑耐藥。 本研究以人膽管癌細胞細胞株RBE為研究對象，以Bcl-2/Bcl-W/Bcl-xL抑制劑ABT737為工具，探討B(tài)cl-2家族及線粒體動力學在人膽管癌細胞順鉑耐藥中的作用及機制，為膽管癌治療提供新的治療策略和方向。 方法 （1）細胞生存率由MTT法檢測，Hoechst33342染色檢測細胞核凋亡形態(tài)變化，細胞凋亡由Annexin V/PI染色后流式細胞術定量。DCFH-DA染色標識ROS變化，JC-1染色顯示線粒體膜電勢變化并由流式細胞術定量。 （2）Western blot檢測細胞總蛋白Bcl-2、Bak、Mcl-1蛋白水平。線粒體分離試劑盒獲取線粒體和胞漿成分,并提取蛋白。Western blot檢測胞漿蛋白細胞色素C、Bcl-2蛋白水平。 （3）MitoTracker Red特異性標志線粒體，激光共聚焦觀測線粒體形態(tài)，同時Hoechst33342標記細胞核。Western blot檢測細胞總蛋白中分裂融合相關蛋白Mfn2、OPA1、Drp1、Fis1蛋白水平，線粒體蛋白及胞漿蛋白中Drp1蛋白水平。間接免疫熒光染色，激光共聚焦觀察線粒體與Drp1共定位。 （4）Western blot檢測細胞總蛋白中p62和LC3蛋白水平。間接免疫熒光染色，激光共聚焦觀察線粒體(MitoTracker Red)與p62、與LC3共定位。激光共聚焦觀察LysoTracker Red（特異標記酸性細胞器）與MitoTracker Green（標記線粒體）共定位。 （5）免疫熒光染色后激光共聚焦觀察不同時間點細胞內p62表達及線粒體與p62共定位情況。 （6）依據(jù)p62基因序列（GenBank：NM_003900），構建pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi重組質粒，命名為Si-p62，通過Western blot、熒光觀察等技術驗證。 （7）檢測RNAi p62后，細胞生存率由MTT法檢測。Western blot檢測細胞總蛋白中p62、Tom20、Drp1的表達水平。 結果 （1）ABT737合加順鉑能夠有效地誘導人膽管癌細胞凋亡，而相同濃度順鉑只能致極少數(shù)細胞發(fā)生凋亡。聯(lián)合用藥能增加ROS蓄積、誘導線粒體膜電勢的下降，，并誘導更多細胞色素C由線粒體向細胞漿釋放。 （2）與單加順鉑組相比， ABT737聯(lián)合順鉑可明顯增高Mcl-1(32kD)/Mcl-1(40kD)比例、Bak表達量并影響B(tài)cl-2的線粒體定位。 （3）順鉑能夠誘導人膽管癌細胞線粒體融合。合加ABT737能夠下調Mfn2、OPA1(120kD)表達，上調線粒體分裂蛋白Fis1水平，增加Drp1(60kD)/(80kD)比例，并可促進Drp1(60kD)向線粒體移位，線粒體主要以分裂形式存在，且線粒體分裂發(fā)生于凋亡之前。抑制線粒體分裂可部分減輕聯(lián)合用藥的殺傷作用。 （4）單加順鉑和ABT737均能夠輕度誘導人膽管癌細胞自噬活化，而聯(lián)合用藥能夠明顯強化自噬的活化。ABT737聯(lián)合順鉑可以促進線粒體和p62、LC3、酸性細胞器的相互作用及并降低Tom20蛋白水平。RNAi p62后升高Tom20，同時提高人膽管癌細胞生存率。 （5）ABT737聯(lián)合順鉑作用時，p62聚集體在線粒體分裂為主細胞中明顯多于以線粒體融合為主的細胞，同時RNAip62后，影響Drp1表達，特別是影響Drp1(60kD)/Drp1(80kD)比例。 結論 本研究以人膽管癌細胞株RBE作為研究對象，發(fā)現(xiàn)RBE細胞對順鉑敏感性差，而合加ABT737后可明顯增加順鉑的殺傷作用。合加后發(fā)現(xiàn)ROS蓄積、線粒體膜電勢下降，更多細胞色素C釋放，提示順鉑對膽管癌殺傷作用差可能與線粒體損傷不足有關；進一步研究發(fā)現(xiàn)：合加組影響B(tài)cl-2家族蛋白表達量及亞細胞定位，提示Bcl-2家族蛋白可能影響膽管癌對順鉑反應性。 順鉑可明顯誘導RBE細胞線粒體融合，而合加ABT737后可逆轉為線粒體分裂，線粒體分裂早于凋亡發(fā)生，且抑制分裂能夠提高細胞生存率，提示線粒體融合是膽管癌耐受順鉑的機制之一，同時干預融合可以逆轉順鉑耐藥；合加ABT737后自噬明顯活化，且順鉑單加組線粒體自噬不明顯，合加組線粒體自噬明顯增多。抑制線粒體自噬后，細胞生存率提升。提示ABT737合加順鉑可能通過誘導過度線粒體自噬導致細胞死亡�；谝陨辖Y果，我們推測膽管癌的順鉑耐藥與其線粒體動力學密切相關。 ABT737聯(lián)合順鉑作用，p62聚集體在線粒體分裂為主的細胞中明顯多于以線粒體融合為主的細胞，降低p62后，影響Drp1表達并影響線粒體自噬。提示p62可能通過影響線粒體動力學干預聯(lián)合用藥對人膽管癌細胞的殺傷作用。 綜上，我們以人膽管癌細胞系RBE作為研究對象，以Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-W抑制劑ABT737作為研究工具，證明膽管癌可能通過影響B(tài)cl-2家族蛋白表達水平及定位、降低線粒體損傷、影響線粒體動力學來抵抗順鉑殺傷作用。ABT737能夠干擾上述過程，增加膽管癌對順鉑的敏感性�？赡転榕R床治療膽管癌提供新的化療方案。
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圖 1.1 線粒體凋亡途徑及外源性凋亡途徑體動力學與凋亡粒體分裂融合與凋亡線粒體分裂融合線粒體多被描述為扁豆樣的細胞器均勻散落在細胞漿之中，體通常是呈條索狀、相互交織甚至呈網(wǎng)狀（networks）。線斷變化之中，即通過調整線粒體分離和融合過程以產生較短]。研究者誘導由不同標簽標記的線粒體膜發(fā)生融合，融合發(fā)可完成內部成分的充分混合[64]。進一步研究證明，在能量離子水平波動和有絲分裂等應激條件下，線粒體可以在短時

1.3 線粒體分裂與線粒體嵴重構共同參與調控細胞色素 C 的釋放左側：在某些依賴于 Bax/Bak 的刺激下，Bax 轉位于線粒體外膜，并在之后的線位點出寡聚化，最終導致線粒體內外膜間隙中的少量細胞色素 C 等釋放入細rp1 亦可能參與這一過程）。MOMP 發(fā)生的同時，Drp1 可與釋放出的因子 DDP/TIM作用，并重新募集至線粒體，誘導線粒體分裂，并導致 OPA1 的失能。最終導致的完全開放，釋放出嵴內部之細胞色素 C；右側：黑色箭頭，當細胞色素 C 完全胞迅速死亡；紅色箭頭：當線粒體分裂被抑制后，線粒體嵴內的細胞色素 C 不釋ase 激活受限，細胞存活時間延長。需要注意的是：盡管Drp1是目前公認調控線粒體分裂融合最主要的蛋白分裂仍是一種受多種蛋白調控的過程。Ishihara等在Drp1敲除小鼠的M，用放線菌素D仍可刺激線粒體分裂[81]。因此，需要觀察其他線粒體分白的異常表達是否影響線粒體分裂和凋亡，以佐證二者之間的關系[84
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.8

【參考文獻】

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本文編號：2536034