腫瘤壞死因子α誘導蛋白8在胃腺癌侵襲轉移中的作用研究

發(fā)布時間：2019-09-11 20:40

【摘要】：[研究背景與目的]：胃癌(gastric cancer, GC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,也是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第四位,死亡率第二位的腫瘤。在中國,居消化道惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率首位。胃癌大多發(fā)病隱匿、惡性程度高、病情發(fā)展較迅速且容易發(fā)生遠處轉移,盡管隨著醫(yī)療水平不斷提高,在早期診斷及綜合治療方面取得了巨大進步,但手術切除依然是目前治愈胃癌的唯一手段。胃癌在不同區(qū)域間發(fā)病率變化較大,這與胃癌危險因素的分布息息相關。胃癌的危險因素主要包括：幽門螺桿菌感染、不良的生活習慣(吸煙、飲酒、煙熏鹽漬食物等)、慢性萎縮性胃炎及胃潰瘍等。胃癌的早期診斷率仍不足10%,中晚期胃癌預后很差。胃癌包括多種病理類型,其中胃腺癌占到了胃癌總數(shù)的90%,是本課題組的主要研究對象。胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移是多因素、多階段、多基因參與的,研究參與此過程的易感基因以及相關細胞因子必定有助于了解胃癌的生物學行為和判定評估患者的預后。尋求有利于早期診斷、治療及評價預后的有效生物學靶標是當前胃癌研究的重要內(nèi)容之一。腫瘤壞死因子α誘導蛋白(tumor necrosis factor-alpha-induced protein,TNFAIP)家族,是由腫瘤壞死因子a (tumor necrosis factor a, TNFα)誘導產(chǎn)生的,通過NF-κB的激活而發(fā)揮作用,參與多種生物學過程。TNFAIP8家族蛋白屬于此家族中新發(fā)現(xiàn)的一類,包括TIPE(TNFAIP8), TIPE1 (TNFAIP8L1), TIPE2 (TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3)。其蛋白質結構域中含有一個死亡結構域(death effecter domain, DED),在調(diào)節(jié)細胞增殖、調(diào)亡炎癥發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用,國內(nèi)外相關研究表明,在人類多種實體腫瘤中,TNFAIP8過表達能加速細胞增殖,從而促使腫瘤生長；沉默TNFAIP8基因后,腫瘤細胞的增殖、生長明顯減弱。認為TNFAIP8的表達與其發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移以及不良預后有明顯的相關性。由此可見,TNFAIP8在腫瘤浸潤轉移過程中可能起關鍵作用。但是,有關TNFAIP8在我國高發(fā)疾病胃癌中的相關研究報道較少,特別是目前國內(nèi)外尚沒有關于TNFAIP8的表達情況與臨床病理特征包括腫瘤標志物血清CA72-4及預后關系的研究。同時TNFAIP8在胃癌侵襲轉移中是如何發(fā)揮作用的機制尚不明確。本研究通過免疫組織化學方法檢測TNFAIP8在胃腺癌原發(fā)灶、癌旁正常胃粘膜組織及相應淋巴結轉移灶中的表達情況,并詳細分析其表達水平與臨床病理特征包括預后的關系。進一步采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術,合成TNFAIP8基因小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)轉染干擾胃癌細胞,觀察TNFAIP8 siRNA轉染對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力的影響,并分析探討TNFAIP8參與侵襲、轉移的可能機制。[方法]：1. TNFAIP8在胃腺癌中的表達情況：選取山東省醫(yī)科院附院病理科存檔的106例胃腺癌原發(fā)灶及癌旁正常胃粘膜組織和相應60例淋巴結轉移灶,這106例患者的臨場資料也被統(tǒng)計。應用免疫組化方法檢測TNFAIP8表達,分析TNFAIP8表達水平與胃腺癌患者臨床病理特征的關系。生存分析方法評價TNFAIP8表達對胃腺癌患者預后的影響。2. TNFAIP8基因的干擾RNA體外合成及對胃癌細胞系的干預：使用Western Blot方法檢測胃癌細胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表達量,篩選出TNFAIP8基因表達量最高的細胞系,合成TNFAIP8基因的干擾RNA(TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、TNFAIP8 siRNA3),并利用基因轉染技術將三組干擾RNA分別轉染進該胃癌細胞株,應用流式細胞儀觀察轉染效率,分別采用實時熒光定量PCR和Western Blot方法檢測基因轉染后的TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達,評價干擾效果。3. TNFAIP8對胃癌細胞侵襲轉移能力的影響及機制探討：篩選出沉默效率最高的一組序列,采用平板實驗檢測各組細胞單克隆形成能力,CCK-8的方法檢測細胞增殖能力的變化,采用Transwe11小室方法分別檢測細胞侵襲能力及轉移能力的變化,采用Western Blot方法檢測細胞TNFAIP8基因轉染前后胃癌相關基因(MMP-2、MMP-9)在蛋白水平上的表達變化,探討TNFAIP8促進腫瘤細胞侵襲轉移的可能機制。[結果]：1. TNFAIP8在癌旁相應淋巴結轉移灶、胃腺癌原發(fā)灶、和正常胃粘膜組織中高表達率依次下降,分別為81.7%(49/60),47.2%(50/106)和0,三組間有統(tǒng)計學差異,兩兩比較也有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)：且伴淋巴結轉移原發(fā)灶的高表達率60.0%(36/60)明顯高于無淋巴結轉移的原發(fā)灶30,4(14/46),兩者比較也有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。2. TNFAIP8表達與血管侵犯,TNM分期,T分級,淋巴結轉移及外周血血清CA72-4水平呈正相關。3. Kaplan-Meier方法生存分析結果顯示TNFAIP8表達與預后呈負相關,TNFAIP8高表達的胃腺癌患者總生存率低于TNFAIP8低表達的患者。Cox多因素分析結果表明TNFAIP8表達水平是胃腺癌患者獨立的預后標志(RR1.736,P=0.029)。4.小干擾RNA轉染：使用Western Blot方法檢測胃癌細胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表達量,發(fā)現(xiàn)SGC7901中TNFAIP8基因的表達量最高。通過轉染試劑HiperFect分別將TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、 TNFAIP8siRNA3和陰性對照siRNA轉染入胃癌細胞SGC7901,結果TNFAIP8 siRNA2組的沉默效率最高,轉染干擾序列后,TNFAIP8基因在RNA水平和蛋白水平的表達明顯下降。5. TNFAIP8對胃癌細胞侵襲轉移的影響及機制探討：胃癌細胞SGC7901在干擾后,腫瘤細胞的單克隆形成能力、細胞增殖能力、遷移能力和侵襲能力均明顯下降,胃癌細胞中MMP-2、MMP-9在蛋白水平表達均下調(diào)。[結論]：1. TNFAIP8在胃腺癌中高表達,TNFAIP8在淋巴結轉移灶中高表達率高于原發(fā)灶。研究TNFAIP8在胃腺癌中表達很有價值。2. TNFAIP8的表達水平與胃腺癌的侵襲轉移呈正相關,與預后呈負相關,TNFAIP8對判斷胃腺癌患者的預后有意義,亦可能成為一個潛在的治療靶點。3. TNFAIP8 siRNA能夠抑制胃癌細胞SCG7901中內(nèi)源性TNFAIP8的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP8基因可以增強胃癌細胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力,同時可以下調(diào)胃癌相關基因的表達,對胃癌的發(fā)生發(fā)展起到了重要作用。
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胃腺癌