腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8在胃腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究

發(fā)布時(shí)間：2019-09-11 20:40

【摘要】：[研究背景與目的]：胃癌(gastric cancer, GC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,也是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第四位,死亡率第二位的腫瘤。在中國,居消化道惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率首位。胃癌大多發(fā)病隱匿、惡性程度高、病情發(fā)展較迅速且容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,盡管隨著醫(yī)療水平不斷提高,在早期診斷及綜合治療方面取得了巨大進(jìn)步,但手術(shù)切除依然是目前治愈胃癌的唯一手段。胃癌在不同區(qū)域間發(fā)病率變化較大,這與胃癌危險(xiǎn)因素的分布息息相關(guān)。胃癌的危險(xiǎn)因素主要包括：幽門螺桿菌感染、不良的生活習(xí)慣(吸煙、飲酒、煙熏鹽漬食物等)、慢性萎縮性胃炎及胃潰瘍等。胃癌的早期診斷率仍不足10%,中晚期胃癌預(yù)后很差。胃癌包括多種病理類型,其中胃腺癌占到了胃癌總數(shù)的90%,是本課題組的主要研究對象。胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多因素、多階段、多基因參與的,研究參與此過程的易感基因以及相關(guān)細(xì)胞因子必定有助于了解胃癌的生物學(xué)行為和判定評估患者的預(yù)后。尋求有利于早期診斷、治療及評價(jià)預(yù)后的有效生物學(xué)靶標(biāo)是當(dāng)前胃癌研究的重要內(nèi)容之一。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白(tumor necrosis factor-alpha-induced protein,TNFAIP)家族,是由腫瘤壞死因子a (tumor necrosis factor a, TNFα)誘導(dǎo)產(chǎn)生的,通過NF-κB的激活而發(fā)揮作用,參與多種生物學(xué)過程。TNFAIP8家族蛋白屬于此家族中新發(fā)現(xiàn)的一類,包括TIPE(TNFAIP8), TIPE1 (TNFAIP8L1), TIPE2 (TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3)。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個死亡結(jié)構(gòu)域(death effecter domain, DED),在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、調(diào)亡炎癥發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用,國內(nèi)外相關(guān)研究表明,在人類多種實(shí)體腫瘤中,TNFAIP8過表達(dá)能加速細(xì)胞增殖,從而促使腫瘤生長；沉默TNFAIP8基因后,腫瘤細(xì)胞的增殖、生長明顯減弱。認(rèn)為TNFAIP8的表達(dá)與其發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后有明顯的相關(guān)性。由此可見,TNFAIP8在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中可能起關(guān)鍵作用。但是,有關(guān)TNFAIP8在我國高發(fā)疾病胃癌中的相關(guān)研究報(bào)道較少,特別是目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于TNFAIP8的表達(dá)情況與臨床病理特征包括腫瘤標(biāo)志物血清CA72-4及預(yù)后關(guān)系的研究。同時(shí)TNFAIP8在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中是如何發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測TNFAIP8在胃腺癌原發(fā)灶、癌旁正常胃粘膜組織及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況,并詳細(xì)分析其表達(dá)水平與臨床病理特征包括預(yù)后的關(guān)系。進(jìn)一步采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),合成TNFAIP8基因小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)轉(zhuǎn)染干擾胃癌細(xì)胞,觀察TNFAIP8 siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響,并分析探討TNFAIP8參與侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。[方法]：1. TNFAIP8在胃腺癌中的表達(dá)情況：選取山東省醫(yī)科院附院病理科存檔的106例胃腺癌原發(fā)灶及癌旁正常胃粘膜組織和相應(yīng)60例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,這106例患者的臨場資料也被統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用免疫組化方法檢測TNFAIP8表達(dá),分析TNFAIP8表達(dá)水平與胃腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。生存分析方法評價(jià)TNFAIP8表達(dá)對胃腺癌患者預(yù)后的影響。2. TNFAIP8基因的干擾RNA體外合成及對胃癌細(xì)胞系的干預(yù)：使用Western Blot方法檢測胃癌細(xì)胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表達(dá)量,篩選出TNFAIP8基因表達(dá)量最高的細(xì)胞系,合成TNFAIP8基因的干擾RNA(TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、TNFAIP8 siRNA3),并利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將三組干擾RNA分別轉(zhuǎn)染進(jìn)該胃癌細(xì)胞株,應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率,分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot方法檢測基因轉(zhuǎn)染后的TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達(dá),評價(jià)干擾效果。3. TNFAIP8對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制探討：篩選出沉默效率最高的一組序列,采用平板實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞單克隆形成能力,CCK-8的方法檢測細(xì)胞增殖能力的變化,采用Transwe11小室方法分別檢測細(xì)胞侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力的變化,采用Western Blot方法檢測細(xì)胞TNFAIP8基因轉(zhuǎn)染前后胃癌相關(guān)基因(MMP-2、MMP-9)在蛋白水平上的表達(dá)變化,探討TNFAIP8促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。[結(jié)果]：1. TNFAIP8在癌旁相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、胃腺癌原發(fā)灶、和正常胃粘膜組織中高表達(dá)率依次下降,分別為81.7%(49/60),47.2%(50/106)和0,三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,兩兩比較也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)：且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原發(fā)灶的高表達(dá)率60.0%(36/60)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶30,4(14/46),兩者比較也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2. TNFAIP8表達(dá)與血管侵犯,TNM分期,T分級,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及外周血血清CA72-4水平呈正相關(guān)。3. Kaplan-Meier方法生存分析結(jié)果顯示TNFAIP8表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān),TNFAIP8高表達(dá)的胃腺癌患者總生存率低于TNFAIP8低表達(dá)的患者。Cox多因素分析結(jié)果表明TNFAIP8表達(dá)水平是胃腺癌患者獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志(RR1.736,P=0.029)。4.小干擾RNA轉(zhuǎn)染：使用Western Blot方法檢測胃癌細(xì)胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)SGC7901中TNFAIP8基因的表達(dá)量最高。通過轉(zhuǎn)染試劑HiperFect分別將TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、 TNFAIP8siRNA3和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞SGC7901,結(jié)果TNFAIP8 siRNA2組的沉默效率最高,轉(zhuǎn)染干擾序列后,TNFAIP8基因在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)明顯下降。5. TNFAIP8對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制探討：胃癌細(xì)胞SGC7901在干擾后,腫瘤細(xì)胞的單克隆形成能力、細(xì)胞增殖能力、遷移能力和侵襲能力均明顯下降,胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9在蛋白水平表達(dá)均下調(diào)。[結(jié)論]：1. TNFAIP8在胃腺癌中高表達(dá),TNFAIP8在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)率高于原發(fā)灶。研究TNFAIP8在胃腺癌中表達(dá)很有價(jià)值。2. TNFAIP8的表達(dá)水平與胃腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),與預(yù)后呈負(fù)相關(guān),TNFAIP8對判斷胃腺癌患者的預(yù)后有意義,亦可能成為一個潛在的治療靶點(diǎn)。3. TNFAIP8 siRNA能夠抑制胃癌細(xì)胞SCG7901中內(nèi)源性TNFAIP8的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP8基因可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力,同時(shí)可以下調(diào)胃癌相關(guān)基因的表達(dá),對胃癌的發(fā)生發(fā)展起到了重要作用。
【圖文】：

胃腺癌