【摘要】：背景在我國(guó),結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是目前引起腫瘤相關(guān)性死亡的第五大病因,其中CRC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是引起結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。對(duì)于實(shí)體腫瘤來(lái)說(shuō),腫瘤組織邊緣部位供血充分、氧分壓高,越靠近中心區(qū)域氧分壓越低,從而導(dǎo)致中心區(qū)域腫瘤細(xì)胞發(fā)生缺氧壞死、產(chǎn)生低氧耐受,并且不同的氧分壓對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有著不同形式的影響;對(duì)于一個(gè)實(shí)體腫瘤來(lái)說(shuō),存在著常氧和低氧等多種微環(huán)境。因此,研究不同微環(huán)境下CRC的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制有重要的意義。研究表明:decorin(DCN)作為一種核心糖蛋白,與相關(guān)受體結(jié)合并內(nèi)化分解致酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase,RTKs)抵抗,從而抑制多種腫瘤細(xì)胞的體外增殖和遷移,如肺癌、腎癌、結(jié)直腸癌。但DCN抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外侵襲的作用及機(jī)制尚不十分清楚,本研究將探討在常氧和低氧條件下DCN對(duì)結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116體外侵襲能力的影響及其可能機(jī)制。目的本文探討在常氧和CoCl_2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境下,DCN對(duì)人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116體外侵襲的作用,并探討和比較常氧和CoCl_2誘導(dǎo)的低氧條件下DCN與HIF-1α/CD133/TIMP-2通路的關(guān)系,從而為臨床實(shí)體腫瘤的治療提供新的思路。方法用化學(xué)性低氧模擬劑CoCl_2處理人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116,建立化學(xué)性低氧模型;在此低氧模型的基礎(chǔ)上,用DCN處理HCT116細(xì)胞:(1)通過(guò)MTT法檢測(cè)常氧和低氧環(huán)境下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞體外增殖能力的影響;(2)Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)常氧和低氧環(huán)境下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞體外侵襲能力的影響;(3)Real-time PCR法檢測(cè)常氧和低氧環(huán)境下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞CD133和TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響;(4)Western blot法檢測(cè)常氧和低氧環(huán)境下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞中HIF-1α、CD133和TIMP-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果一、篩選適宜濃度的CoCl_2,建立化學(xué)性低氧模型1.1 MTT結(jié)果:CoCl_2對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴性,隨著CoCl_2濃度的增加,抑制作用逐漸增加(P0.05)。1.2 Western blot結(jié)果:CoCl_2對(duì)HCT116細(xì)胞HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白的表達(dá)有雙向調(diào)節(jié)作用,隨CoCl_2濃度的升高HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白的表達(dá)先升高后降低。本實(shí)驗(yàn)研究CoCl_2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境中DCN抑制HCT116細(xì)胞的體外侵襲機(jī)制,因此結(jié)合上述結(jié)果,選取對(duì)細(xì)胞增殖影響小并對(duì)HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白表達(dá)改變較大的100μmol/LCoCl_2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。二、不同濃度的DCN對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響MTT法檢測(cè)不同濃度的DCN對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示,DCN濃度為0.5、1和3 mg/L時(shí)對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用(P0.05);DCN濃度為6 mg/L時(shí),HCT116細(xì)胞的增殖能力明顯下降(P0.01)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1 mg/L和3 mg/L的DCN進(jìn)行體外侵襲實(shí)驗(yàn)。三、常氧和低氧條件下DCN抑制HCT116細(xì)胞的體外侵襲能力3.1 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)常氧條件下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞體外侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,DCN濃度為0、1和3 mg/L時(shí)HCT116細(xì)胞的侵襲數(shù)分別為(241±46)、(168±46)和(51±17)個(gè)/視野(10×10倍)(P0.01)。3.2 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧條件下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞體外侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,CN、CoCl_2、CoCl_2+DCN(1 mg/L)和CoCl_2+DCN(3 mg/L)各組細(xì)胞的侵襲數(shù)分別為(207±61)、(213±64)、(156±54)和(44±17)個(gè)/視野(10×10倍)(P0.01)。四、常氧和低氧條件下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞中TIMP-2、CD133 mRNA表達(dá)的影響4.1 Real-time PCR結(jié)果顯示:在常氧條件下DCN(3 mg/L)顯著上調(diào)HCT116細(xì)胞中TIMP-2 mRNA的表達(dá)(P0.01),而對(duì)CD133 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響(P0.05);4.2 Real-time PCR結(jié)果顯示:在CoCl_2誘導(dǎo)的低氧條件下DCN(3 mg/L)顯著下調(diào)HCT116細(xì)胞中TIMP-2 mRNA的表達(dá)(P0.01),而對(duì)CD133 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響(P0.05)。五、常氧和低氧條件下DCN對(duì)HCT116細(xì)胞HIF-1α/CD133/TIMP-2蛋白表達(dá)的影響5.1 Western Blot結(jié)果顯示:常氧條件下DCN(3 mg/L)明顯上調(diào)TIMP-2的表達(dá)(P0.01)和HIF-1α的表達(dá)(P0.05),而對(duì)CD133的表達(dá)無(wú)明顯作用(P0.05);5.2 Western Blot結(jié)果顯示:在CoCl_2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境中DCN(3 mg/L)明顯下調(diào)HCT116細(xì)胞中HIF-1α、CD133、TIMP-2蛋白表達(dá)(P0.01)。結(jié)論1.DCN可以抑制人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116的體外增殖能力,且呈濃度依賴性;2.在常氧和CoCl_2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境中,DCN均可以抑制人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116的體外侵襲能力,且有濃度依賴性;3.在常氧和CoCl_2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境中,DCN抑制人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116的體外侵襲能力可能通過(guò)不同機(jī)制發(fā)揮作用。低氧條件下可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α/CD133/TIMP-2通路發(fā)揮作用;常氧條件下可能主要通過(guò)促進(jìn)TIMP-2的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用,而與HIF-1a/CD133通路無(wú)關(guān)。
【圖文】：

表 1 CoCl2對(duì) HCT116 細(xì)胞增殖的影響Tab.1 The inhibition rate of HCT116 cells in CoCl2group （錯(cuò)誤！未n=6）細(xì)胞增殖抑制率%分組 n24 h 48 h 空白對(duì)照組 6 0.000±2.345 0.000±6.795 50 μmol/L·CoCl26 19.990±1.285a16.350±8.787a9100 μmol/L·CoCl26 32.505±9.502a11.936±5.485b1250 μmol/L·CoCl26 48.124±8.516a26.546±6.514ab3500 μmol/L·CoCl26 67.830±7.095a61.687±4.179a7750 μmol/L·CoCl26 72.285±5.456a83.930±1.204a8注：與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較aP<0.05；同濃度 48 h 與 2P<0.01，72 h 與 48 h 之間的比較cP<0.01， 72 h 與 24 h 之間的比

4.1.2 Western blot 法檢測(cè)不同濃度的 CoCl2對(duì) HCT116 細(xì)胞中 HIF-1α / CD133 /TIMP-2 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖 2。CoCl2對(duì) HCT116 細(xì)胞 HIF-1α/ CD133 / TIMP-2 蛋白的表達(dá)有雙向調(diào)節(jié)的作用，隨 CoCl2濃度的升高 HIF-1α/ CD133 / TIMP-2 蛋白的表達(dá)先升高后降低。因?yàn)槲覀儗⒀芯吭?CoCl2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境下 DCN 抑制結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116 的體外侵襲機(jī)制，因此結(jié)合上述結(jié)果，，我們選取了對(duì)細(xì)胞增殖影響小并且對(duì) HIF-1α / CD133 / TIMP-2 蛋白表達(dá)改變較大的 100 μmol/L 濃度的 CoCl2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 滿枋霖;趙良智;孫新;;p21活化激酶在腫瘤中的作用[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2015年06期

本文編號(hào)：2534517