【摘要】：癌癥獨特的能量代謝方式是其惡性表型的標志性特征之一,發(fā)展針對癌癥能量代謝的治療手段將是實現(xiàn)癌癥有效治療的新方向。有多篇報道指出細胞小窩結(jié)構(gòu)的成分蛋白:小窩蛋白1 (caveolin-1,Cav-1)與細胞能量代謝密切相關(guān),同時小窩結(jié)構(gòu)也是細胞與外界環(huán)境進行信息交換的橋梁,其運動性是其功能發(fā)揮的基礎(chǔ)。本文通過研究Cav-1/小窩結(jié)構(gòu)內(nèi)吞及運動性信號途徑,以及Cav-1和線粒體之間的相互作用,揭示Cav-1在細胞能量代謝中所扮演的角色,以及Cav-1運動性的關(guān)鍵作用,取得的主要研究成果如下:1. RalA調(diào)節(jié)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞過程:(a)通過考察牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin)誘導的內(nèi)吞過程中RalA活化狀態(tài)的變化,證明內(nèi)吞過程可觸發(fā)RalA活化。(b)通過檢測RalA持續(xù)活化突變體和顯性負突變體對內(nèi)吞以及RalA,Cav-1結(jié)合水平的影響,說明內(nèi)吞過程的實現(xiàn)以及RalA與Cav-1的結(jié)合都需要RalA活化。(c)利用siRNA的方法抑制RalA的表達,同時轉(zhuǎn)染質(zhì)�；謴推浔磉_,對比抑制前后以及恢復表達后內(nèi)吞水平的變化,證明RalA是Cav-1 /小窩內(nèi)吞的重要調(diào)節(jié)分子。2. RalA通過活化下 游效應(yīng)分子PLD (Phospholipase D)調(diào)節(jié)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞:(a)通過研究PLD二非特異性抑制劑對內(nèi)吞的影響,證實PLD活化對內(nèi)吞的促進作用。(b)采用PLD1和PLD2特異性抑制劑確定只有PLD2是內(nèi)吞的調(diào)節(jié)分子。(c) PLD2抑制劑和突變體對Cav-1-RFP運動性的抑制再次證實PLD2在此過程中的重要作用。(d)通過PA感應(yīng)器GFP-PASS (phosphatidic acid biosensor with superior sensitivity)觀察內(nèi)吞過程中 PLD2 下游產(chǎn)物 PA(phosphatidic acid)在小窩生成并由此促進Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞。3. Cav-1抑制引起線粒體形態(tài)學的改變:(a)采用siRNA的手段抑制Cav-1的表達,同時觀察線粒體形態(tài),發(fā)現(xiàn)線粒體呈現(xiàn)片段化和增長的雙重改變。(b)利用PA-GFP (photoactive-GFP)在線粒體的擴散程度量化線粒體的基質(zhì)融合程度,此結(jié)果亦可代表線粒體的動態(tài)水平。對比Cav-1抑制前后,發(fā)現(xiàn)抑制后細胞的線粒體有更高的動態(tài)水平。(c)通過 FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)方法測試基質(zhì)蛋白的運動速率,進一步強化Cav-1抑制提升線粒體動態(tài)水平的結(jié)論。4. Cav-1通過抑制Mfn2和Drpl的線粒體定位改變線粒體動態(tài):(a)線粒體組分分離發(fā)現(xiàn)抑制Cav-1,Mfn2和Drpl在線粒體的表達量增加。(b)通過免疫共沉淀和 FRET (fluorescence resonance energy transfer)的方法證實 Cav-1 分別與Mfn2和Drp1二者結(jié)合。(c)免疫熒光染色同樣檢測到抑制Cav-1時Drp1在線粒體的定位增加。(d)引入ER和線粒體的人工鏈接分子OMM-ER-mRFP加強ER和線粒體交互,發(fā)現(xiàn)Mfn2在Cav-1抑制的情況下發(fā)生ER回流,說明Cav-1可能通過調(diào)節(jié)ER和線粒體交互來調(diào)整Mfn2在二者的表達水平。5. Cav-1的抑制是線粒體自噬的誘因:(a)對比Cav-1抑制前后線粒體比量的變化發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制導致線粒體比量減少。(b)通過對比細胞自噬標志分子表達量,發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制細胞的自噬水平升高。(c)引入mt-Keima檢測線粒體自噬,證實Cav-1的低表達可誘導線粒體自噬的發(fā)生。6. RalA通過Cav-1影響線粒體功能和細胞能量代謝:(a)采用siRNA的手段實現(xiàn)RalA和Cav-1的單獨和共同抑制。(b)檢測MMP,ATP,H2O2和糖酵解產(chǎn)物L-lactate的生成,發(fā)現(xiàn)RalA和Cav-1抑制的細胞中出現(xiàn)MMP和ATP生成的降低以及H2O2和L-lactate的增加,并且RalA和Cav-1共同抑制時與單獨抑制Cav-1結(jié)果無異,證明RalA的作用是借Cav-1發(fā)揮的�？傊�,本論文通過對Cav-1/小窩內(nèi)吞途徑的分析確立了 RalA在此過程中的重要調(diào)節(jié)作用,并證實該作用是通過其下游效應(yīng)分子PLD催化PA在小窩生成而實現(xiàn)的。通過研究Cav-1與線粒體的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制Mfn2和Drp1的線粒體表達進而調(diào)節(jié)線粒體動態(tài)水平和線粒體自噬。最后將RalA和Cav-1聯(lián)系起來,說明Cav-1的表達水平和運動性均能對線粒體功能和細胞能量代謝帶來重大影響。
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【學位授予單位】：電子科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R73-3

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10 王s，

本文編號：2516206