【摘要】：PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor type 1)是一種非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶,主要通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平發(fā)揮功能,參與細胞增殖、生長和遷移的多個細胞信號通路的調(diào)節(jié)。研究表明,PTPN1在多種腫瘤組織中表達異常,并參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)PTPN1在食管癌組織中存在高表達,是CRT促進食管癌肺轉(zhuǎn)移的關鍵下游分子。本研究旨在進一步深入探討PTPN1促進食管癌細胞侵襲運動的分子機制。首先,我們通過在食管癌細胞中敲降PTPN1驗證了PTPN1可正向調(diào)控食管癌細胞的侵襲運動能力。同時,我們發(fā)現(xiàn)敲降PTPN1可降調(diào)EGFR表達和Erk1/2的活性。通過siRNA敲降EGFR和抑制劑抑制Erk1/2的活性,我們驗證了EGFR-Erk1/2通路對食管癌細胞侵襲運動能力的正向調(diào)控,并通過回復實驗證實了PTPN1主要通過激活EGFR-Erk1/2通路增強食管癌細胞的侵襲運動能力。接著,我們通過Realtime PCR、MG132等實驗發(fā)現(xiàn)PTPN1主要在mRNA水平調(diào)控EGFR的表達,進一步的核質(zhì)分離實驗和免疫熒光檢測表明PTPN1可促進EGFR的轉(zhuǎn)錄因子Spl的漿核易位。為深入研究PTPN1對EGFR-Erk1/2通路以及食管癌細胞侵襲運動能力的調(diào)節(jié)機制,我們通過GST Pull-down聯(lián)合LC/MS/MS技術高通量篩選了PTPN1在食管癌中潛在的相互作用蛋白共358個,并利用免疫共沉淀和免疫熒光技術對其中的高分候選分子MYH9在食管癌細胞中和PTPN1的相互作用進行了驗證。MYH9為非肌型肌球蛋白重鏈ⅡA,參與細胞遷移、粘附及胞質(zhì)分裂等多個過程,被報道與多個蛋白包括Spl的異常定位相關,而其與PTPN1的相互作用尚未見文獻報道。為確定MYH9的調(diào)控作用,我們在食管癌細胞中敲降MYH9,發(fā)現(xiàn)食管癌細胞的侵襲運動能力和EGFR的蛋白及mRNA水平顯著降低,并伴隨著Spl的核漿易位。然而MYH9的ATPase抑制劑Blebbistatin并不能影響食管癌細胞的侵襲能力和EGFR的表達,進一步的回復實驗證實MYH9的桿狀尾部在MYH9對EGFR的調(diào)控中起到關鍵作用。以上結(jié)果提示MYH9可能通過其桿狀尾部而不依賴其細胞骨架功能完整性介導PTPN1對食管癌細胞侵襲運動能力和EGFR蛋白表達的調(diào)控。為進一步確定MYH9是否為PTPN1的關鍵下游分子,我們首先通過Phos-tag技術以及免疫沉淀法聯(lián)合廣譜酪氨酸磷酸化抗體檢測發(fā)現(xiàn)PTPN1可促進MYH9的酪氨酸去磷酸化。結(jié)合數(shù)據(jù)庫信息,我們利用PTPN1底物捕獲突變體和MYH9桿狀尾部的非磷酸化突變體證實了PTPN1直接作用于MYH9的Y1408位點。接著,我們使用PTPN1的活性損傷突變體驗證了PTPN1通過其酪氨酸磷酸酶活性促進食管癌細胞的侵襲運動和EGFR的表達,并通過MYH9桿狀尾部的持續(xù)磷酸化突變體和非磷酸化突變體的回復實驗證實了MYH9桿狀尾部的Y1408非磷酸化形式在PTPN1促進EGFR表達中的關鍵作用。本研究揭示PTPN1在食管癌細胞中通過MYH9提高EGFR蛋白表達而促進食管癌細胞侵襲運動的分子機制,為進一步闡明PTPN1在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的線索。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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