【摘要】：PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor type 1)是一種非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶,主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平發(fā)揮功能,參與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和遷移的多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。研究表明,PTPN1在多種腫瘤組織中表達(dá)異常,并參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)PTPN1在食管癌組織中存在高表達(dá),是CRT促進(jìn)食管癌肺轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵下游分子。本研究旨在進(jìn)一步深入探討PTPN1促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制。首先,我們通過在食管癌細(xì)胞中敲降PTPN1驗(yàn)證了PTPN1可正向調(diào)控食管癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)能力。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)敲降PTPN1可降調(diào)EGFR表達(dá)和Erk1/2的活性。通過siRNA敲降EGFR和抑制劑抑制Erk1/2的活性,我們驗(yàn)證了EGFR-Erk1/2通路對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力的正向調(diào)控,并通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTPN1主要通過激活EGFR-Erk1/2通路增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)能力。接著,我們通過Realtime PCR、MG132等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PTPN1主要在mRNA水平調(diào)控EGFR的表達(dá),進(jìn)一步的核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)和免疫熒光檢測(cè)表明PTPN1可促進(jìn)EGFR的轉(zhuǎn)錄因子Spl的漿核易位。為深入研究PTPN1對(duì)EGFR-Erk1/2通路以及食管癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)機(jī)制,我們通過GST Pull-down聯(lián)合LC/MS/MS技術(shù)高通量篩選了PTPN1在食管癌中潛在的相互作用蛋白共358個(gè),并利用免疫共沉淀和免疫熒光技術(shù)對(duì)其中的高分候選分子MYH9在食管癌細(xì)胞中和PTPN1的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。MYH9為非肌型肌球蛋白重鏈ⅡA,參與細(xì)胞遷移、粘附及胞質(zhì)分裂等多個(gè)過程,被報(bào)道與多個(gè)蛋白包括Spl的異常定位相關(guān),而其與PTPN1的相互作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為確定MYH9的調(diào)控作用,我們?cè)谑彻馨┘?xì)胞中敲降MYH9,發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)能力和EGFR的蛋白及mRNA水平顯著降低,并伴隨著Spl的核漿易位。然而MYH9的ATPase抑制劑Blebbistatin并不能影響食管癌細(xì)胞的侵襲能力和EGFR的表達(dá),進(jìn)一步的回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MYH9的桿狀尾部在MYH9對(duì)EGFR的調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。以上結(jié)果提示MYH9可能通過其桿狀尾部而不依賴其細(xì)胞骨架功能完整性介導(dǎo)PTPN1對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力和EGFR蛋白表達(dá)的調(diào)控。為進(jìn)一步確定MYH9是否為PTPN1的關(guān)鍵下游分子,我們首先通過Phos-tag技術(shù)以及免疫沉淀法聯(lián)合廣譜酪氨酸磷酸化抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PTPN1可促進(jìn)MYH9的酪氨酸去磷酸化。結(jié)合數(shù)據(jù)庫信息,我們利用PTPN1底物捕獲突變體和MYH9桿狀尾部的非磷酸化突變體證實(shí)了PTPN1直接作用于MYH9的Y1408位點(diǎn)。接著,我們使用PTPN1的活性損傷突變體驗(yàn)證了PTPN1通過其酪氨酸磷酸酶活性促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)和EGFR的表達(dá),并通過MYH9桿狀尾部的持續(xù)磷酸化突變體和非磷酸化突變體的回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MYH9桿狀尾部的Y1408非磷酸化形式在PTPN1促進(jìn)EGFR表達(dá)中的關(guān)鍵作用。本研究揭示PTPN1在食管癌細(xì)胞中通過MYH9提高EGFR蛋白表達(dá)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制,為進(jìn)一步闡明PTPN1在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的線索。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2509759