【摘要】：肺癌的發(fā)病率和死亡率居全世界人類腫瘤之首。根據(jù)病理組織學分類,肺癌可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),其中又以NSCLC最為多見,約占肺癌總數(shù)的80%,NSCLC包括腺癌、鱗癌和大細胞癌等。雖然近年來NSCLC的診斷治療取得了長足的進步,尤其是分子靶向藥物等治療獲得了可喜的成績,但是仍有70%的NSCLC患者在確診肺癌的時候已經(jīng)處于晚期并存在遠處轉(zhuǎn)移,這部分病人的5年生存率僅為15%。因此,為提高NSCLC患者的5年生存率必須克服遠處轉(zhuǎn)移這一難題。目前我們對腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的機制仍知之甚少,仍需深入研究探討,這將對減少NSCLC患者轉(zhuǎn)移復發(fā)、延長生存時間、提高生活質(zhì)量具有重要意義。腫瘤的發(fā)生發(fā)展及遠處轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞所處的腫瘤微環(huán)境密切相關,其中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要意義。ECM在維持細胞組織穩(wěn)態(tài)和腫瘤細胞侵襲遷移方面至關重要。容易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移的腫瘤常常通過多種ECM降解蛋白酶如:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)來提高腫瘤侵襲性。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)解聚素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteases,ADAMs)分子結構與MMPs家族具有高度同源性,因此我們猜想ADAMs家族成員可能影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。ADAMs屬于蛋白酶家族,通過降解ECM和膜結合前體分子來改變細胞與細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)間的狀態(tài)。根據(jù)位置分布可將ADAMs分為:膜型ADAM和分泌型ADAM,分泌型ADAM又稱為含Ⅰ型血小板反應蛋白的解聚素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs,ADAMTS)。目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)ADAMTS高表達,并且可通過降解ECM提高腫瘤細胞侵襲性和轉(zhuǎn)移性。如ADAM-8、ADAM-12、ADAM-15和ADAM-28在NSCLC中高表達,ADAM-9和ADAM-12在乳腺癌中高表達,ADAMTS4和ADAMTS5在膠質(zhì)母細胞瘤中高表達。ADAMTS5是蛋白酶家族中的新成員,已被證實在膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤細胞株和腫瘤組織中高表達,有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復發(fā)轉(zhuǎn)移,但其生物學作用機制仍需進一步探索。本研究將通過檢測ADAMTS5在NSCLC組織和細胞株中的表達水平,結合體外細胞系研究,通過小干擾技術,探討ADAMTS5在NSCLC中表達的臨床意義以及ADAMTS5在NSCLC發(fā)生發(fā)展及復發(fā)轉(zhuǎn)移中的可能的作用機制。目的:研究ADAMTS5在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表達情況,首先比較分析ADAMTS5的表達在NSCLC患者癌組織和癌旁正常肺組織的表達差異;其次研究分析ADAMTS5的表達與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的相關性以及ADAMTS5對NSCLC患者生存、預后的影響。在細胞水平,研究ADAMTS5對NSCLC細胞生物學行為的影響,分析其發(fā)揮作用的具體分子機制,探討ADAMTS5與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關系,及在NSCLC進程中的影響,探索發(fā)現(xiàn)NSCLC的新的腫瘤標志物,研究提高NSCLC治療效果的新靶點。方法:(1)收集8對成對的新鮮NSCLC患者術后癌組織和癌旁正常肺組織,勻漿后提取蛋白質(zhì),使用免疫印跡分析實驗法(Western blot,WB),在組織水平檢測ADAMTS5在肺癌組織和癌旁正常肺組織中蛋白的表達差異。收集3種NSCLC細胞(A549、H1299和Spca-1),提取細胞蛋白后使用免疫印跡分析實驗法,檢測在細胞水平ADAMTS5蛋白的表達水平差異。(2)收集2007.01-2010.01期間手術切除的140例NSCLC組織標本,設計調(diào)查表,登記每位患者的臨床和病理相關資料,包括性別、年齡、手術時間、腫瘤大小、病理組織類型、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移情況和TNM分期等,同時對患者預后及5年生存時間進行隨訪。使用免疫組織化學染色實驗法(immunohistochemistry,IHC)檢測140例石蠟組織切片中ADAMTS5蛋白的表達情況�；仡櫺哉{(diào)查研究ADAMTS的表達與140例NSCLC患者各項臨床病理參數(shù)間的關系。統(tǒng)計并使用卡方檢驗法分析ADAMTS5蛋白的表達程度與NSCLC患者各項臨床病理參數(shù)之間的相關性;使用COX多因素分析各項臨床病理參數(shù)、ADAMTS5對患者預后的影響;使用Kaplan Meier生存曲線分析ADAMTS5蛋白的表達對于患者生存預后的影響情況。(3)采用針對ADAMTS5的短發(fā)夾sh RNA(short hairpin RNA,sh RNA)干擾質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ADAMTS5-sh RNA轉(zhuǎn)染至ADAMTS5高表達的肺癌細胞株中,建立ADAMTS5基因沉默的肺癌細胞株,檢測干擾效率,挑選效果最好的靶點進行后續(xù)實驗。通過劃痕實驗(Wound healing assays)、Transwell小室模型實驗檢測ADAMTS5對肺癌細胞株體外遷移能力的作用。(4)采用免疫印跡實驗法檢測實驗組和對照組中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白的表達水平趨勢和兩者的關系,檢測ADAMTS5影響肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。結果:(1)在8組成對的NSCLC癌組織和癌旁正常肺組織中,癌組織中ADAMTS5蛋白表達顯著高于癌旁正常肺組織(p0.01,具有統(tǒng)計學意義);在癌旁正常肺組織中,ADAMTS5均為低表達。選取三株NSCLC細胞株(A549,H1299和Spca-1),免疫印跡實驗法檢測提示在三株NSCLC細胞株中,ADAMTS5蛋白高表達。免疫熒光提示ADAMTS5主要分布于細胞漿和細胞外基質(zhì)中。(2)通過免疫組化實驗法在140例NSCLC患者石蠟切片組織中檢測ADAMTS5的表達情況,發(fā)現(xiàn)ADAMTS5主要分布于細胞漿和細胞外基質(zhì)中。其中79例(56.4%)的患者組織切片高表達ADAMTS5,61例(43.6%)的患者組織切片ADAMTS5低表達。并且可以發(fā)現(xiàn)ADAMTS5蛋白在NSCLC組織中高表達程度與淋巴結轉(zhuǎn)移(p0.001)和組織病理分化程度(p0.001)呈正相關,即NSCLC患者伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的患者ADAMTS5表達呈強陽性,而無淋巴轉(zhuǎn)移的患者ADAMTS5表達呈弱陽性;在分化程度較差的NSCLC患者中ADAMTS5蛋白表達明顯高于分化程度相對較好的NSCLC患者。通過回顧性研究發(fā)現(xiàn),ADAMTS5的表達與性別(p=0.043)、淋巴結轉(zhuǎn)移(p0.001)、臨床分期(p=0.036)和組織病理分化(p0.001)等臨床病理因素顯著相關,具有統(tǒng)計學意義,而與吸煙和是否存在遠處轉(zhuǎn)移無顯著相關性。(3)Kaplan Meier生存曲線結果表明,ADAMTS5高表達的病例預后情況較低表達的病例差,其5年生存率低于ADAMTS5低表達的患者(p0.001),ADAMTS5可能是預測患者復發(fā)風險的指標。臨床病理參數(shù)單因素生存分析顯示腫瘤最大徑≥3cm的患者中位生存時間短于腫瘤最大徑3cm的患者(p=0.001),伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的患者中位生存時間較無轉(zhuǎn)移患者短(p0.001),腫瘤低分化的患者的中位生存時間短于分化相對較好的患者(p0.001)以及ADAMTS5高表達的患者中位生存時間短于低表達的患者(p0.001)。另外,COX多因素回歸分析結果示:性別、腫瘤大小、組織分化、分期和ADAMTS的表達情況與NSCLC的預后相關,是NSCLC獨立的預測因素。(4)通過小干擾sh RNA技術沉默ADAMTS5基因,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染了ADAMTS5-sh RNA的NSCLC細胞株A549中,ADAMTS5蛋白低表達。劃痕實驗、Transwell侵襲遷移實驗示ADAMTS5基因沉默后,NSCLC腫瘤細胞侵襲遷移能力顯著減弱。(5)通過小干擾sh RNA技術沉默ADAMTS5基因后,發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)間粘附蛋白降解標志物(E-cadherin)表達增加,波形蛋白(vimentin)表達降低,NSCLC肺癌粘附蛋白降解減少,侵襲遷移力減弱。結論:(1)ADAMTS5在NSCLC中起促癌作用,在NSCLC組織中高表達與腫瘤淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期和組織病理分化呈正相關;在NSCLC中,ADAMTS5高表達的患者預后比低表達患者預后差;提示ADAMTS5高表達對NSCLC的發(fā)生發(fā)展、復發(fā)有促進作用。(2)ADAMTS5參與NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移,可能通過降解細胞外基質(zhì)、細胞外粘附蛋白等發(fā)揮作用;干擾ADAMTS5,NSCLC細胞侵襲遷移力抑制;針對ADAMTS5及其相關信號途徑的生物學靶向性干預,ADAMTS5可能為NSCLC特異性治療提供新策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
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