【摘要】：目的通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探索3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate,3-Br PA)聯(lián)合索拉菲尼(Sorafenib,SOR)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721、Hep G2的抑制作用及其相關(guān)分子機(jī)制。方法1.首先采用MTT法檢測(cè)不同濃度3-Br PA(0,20,40,80,160μmol/L)、索拉菲尼(0,2,4,8,16μmol/L)以及100μmol/L3-Br PA與索拉菲尼(0,2,4,8,16μmol/L)聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721、Hep G2的增殖抑制作用;之后實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、3-Br PA組、SOR組、3-Br PA+SOR組;2.集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用;3.DAPI染色檢測(cè)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)SMMC7721、Hep G2細(xì)胞核的變化;4.PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼誘導(dǎo)SMMC7721、Hep G2細(xì)胞凋亡;5.線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)檢測(cè)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響;6.活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)SMMC7721、Hep G2細(xì)胞胞內(nèi)活性氧水平的影響;7.ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞ATP水平的影響;8.Western blot檢測(cè)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)SMMC7721、Hep G2細(xì)胞Mcl-1、Bcl-2、Bax以及PARP蛋白表達(dá)的影響;9.建立裸鼠的異體移植瘤模型,觀察3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼的體內(nèi)抗腫瘤效果。結(jié)果1.3-Br PA增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)SMMC7721和Hep G2細(xì)胞增殖的抑制作用1.1 3-Br PA、索拉菲尼以及兩藥聯(lián)合作用于SMMC7721、Hep G2細(xì)胞,肝癌細(xì)胞存活率隨濃度增高而降低(P0.05)。100μmol/L3-Br PA與索拉菲尼聯(lián)合作用于SMMC7721、Hep G2細(xì)胞24 h的存活率顯著低于同濃度的索拉菲尼單獨(dú)處理(P0.05)。1.2 100μmol/L3-Br PA、16μmol/L索拉菲尼以及兩藥聯(lián)合作用于人肝癌SMMC7721、Hep G2細(xì)胞24h后,聯(lián)合用藥組于單獨(dú)用藥組相比,細(xì)胞失去正常形態(tài),細(xì)胞間隙明顯增寬,懸浮細(xì)胞數(shù)量明顯增多。1.3為進(jìn)一步3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)人肝癌SMMC7721、Hep G2細(xì)胞的增殖抑制作用,選擇60μmol/L3-Br PA與6μmol/L索拉菲尼聯(lián)合作用于人肝癌SMMC7721、Hep G2細(xì)胞6-8d,進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示3-Br PA能明顯增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG2的增殖抑制作用。2.3-Br PA增強(qiáng)索拉菲尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞SMMC7721和Hep G2凋亡100μmol/L 3-Br PA聯(lián)合16μmol/L索拉菲尼作用于肝癌細(xì)胞SMMC7721和Hep G2細(xì)胞24h,JC-1檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組和單獨(dú)用藥組相比,聯(lián)合用藥組紅色熒光明顯減弱,綠色熒光明顯增強(qiáng),說(shuō)明3-Br PA能增強(qiáng)索拉菲尼引起的線粒體功能發(fā)生障礙,3-Br PA增強(qiáng)索拉菲尼誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞SMMC7721和Hep G2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。我們通過(guò)ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS水平,用3-Br PA誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞6h后,與單獨(dú)用藥組相比,聯(lián)合用藥組肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高。100μmol/L3-Br PA與16μmol/L索拉菲尼聯(lián)合作用于人肝癌SMMC7721、Hep G2細(xì)胞24h后,使用DPAI熒光染色檢測(cè)兩藥聯(lián)合對(duì)人肝癌SMMC7721、Hep G2細(xì)胞核的影響,結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核皺縮濃集,呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光,或細(xì)胞核呈分葉、碎片狀,且明顯多于單獨(dú)用藥組;100μmol/L 3-Br PA聯(lián)合16μmol/L索拉菲尼作用于肝癌SMMC7721和Hep G2細(xì)胞24h,PI單染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721、Hep G2的凋亡率為(47.4±5.02)%、(46.2±4.14)%,明顯高于對(duì)照組和單獨(dú)用藥組(P0.05)。3.3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)SMMC7721和Hep G2細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響通過(guò)ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了100μmol/L 3-Br PA聯(lián)合16μmol/L索拉菲尼處理SMMC7721和Hep G細(xì)胞5h后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼處理5h后,聯(lián)合用藥組SMMC7721細(xì)胞ATP水平降至(18.5±2.63)%,Hep G細(xì)胞ATP水平降至(22.3±4.14)%,與單獨(dú)用藥組比較均有明顯的降低(P0.05)。4.3-Br PA與索拉菲尼聯(lián)合能增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧水平可以降低3-Br PA與索拉菲尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡通過(guò)ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了100μmol/L 3-Br PA聯(lián)合16μmol/L索拉菲尼處理SMMC7721和Hep G細(xì)胞6h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。結(jié)果顯示在SMMC7721細(xì)胞中聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高。通過(guò)NAC(5mmol/L)對(duì)細(xì)胞ROS水平加以抑制,聯(lián)合用藥組SMMC7721細(xì)胞的存活率為(51.2±4.78)%,Hep G2細(xì)胞的聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率為(22.5±5.86)%。加用NAC后SMMC7721細(xì)胞的存活率為(87.2±5.45)%,Hep G2細(xì)胞的聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率為(79.4±4.89)%。結(jié)果顯示通過(guò)NAC抑制細(xì)胞ROS水平,可以明顯降低3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡(P0.05)。5.3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼對(duì)SMMC7721、HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組明顯下調(diào)肝癌細(xì)胞Mcl-1、PARP和Bcl-2的表達(dá)(P0.05),但對(duì)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)無(wú)明顯影響。6.3-Br PA可以增強(qiáng)索拉菲尼體內(nèi)抗腫瘤效果建立人肝癌Hep G細(xì)胞的異種植瘤裸鼠模型,進(jìn)行聯(lián)合用藥的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。用藥第28天處死裸鼠,測(cè)量腫瘤體積并稱(chēng)重。對(duì)照組、3-Br PA組、索拉菲尼組以及聯(lián)合用藥組的腫瘤體積分別為654.83±141.95 mm3、113.07±43.22 mm3、157.42±47.04 mm3、28.71±7.48mm3,結(jié)果顯示于單獨(dú)用藥組相比,聯(lián)合用藥組腫瘤體積明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明3-Br PA聯(lián)合索拉菲尼在體內(nèi)具有良好的抗腫瘤作用,HE染色后在顯微鏡下觀察并拍照,結(jié)果顯示與對(duì)照組和單獨(dú)用藥組比較,聯(lián)合用藥組中組織血管減少,分布混亂,出現(xiàn)大面積的壞死區(qū)域,說(shuō)明3-Br PA能增強(qiáng)索拉菲尼在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果。結(jié)論1.3-Br PA具有增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721、Hep G2的增殖抑制作用,且能增強(qiáng)索拉菲尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡;2.3-Br PA與索拉菲尼聯(lián)合能增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧水平可以降低3-Br PA與索拉菲尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡;3.3-Br PA與索拉菲尼聯(lián)合可以下調(diào)Bcl-2、Mcl-1與PARP的表達(dá);4.3-Br PA可以增強(qiáng)索拉菲尼在體內(nèi)的抗腫瘤作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2489330