發(fā)布時間：2019-05-28 08:46

【摘要】：第一部分PLCE1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：探討PLCE1蛋白在不同食管病變組織中的表達(dá)及臨床意義：觀察PLCE1基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞株生物學(xué)功能學(xué)的影響；初步研究PLCE1基因在食管鱗癌中可能調(diào)控的下游分子和信號通路。 方法：(1)收集石蠟包埋的112例新疆漢族食管鱗癌組織、99例食管鱗癌癌前病變組織(低級別上皮瘤變60例,高級別上皮內(nèi)瘤變39例)和99例癌旁正常組織,制備組織芯片,應(yīng)用免疫組化檢測PLCE1蛋白的表達(dá)并分析其與食管鱗癌臨床病理特征及與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系；(2)檢索PubMed,MEDLINE,EMBASE,Web of science,維普,CNKI數(shù)據(jù)庫,收集從建庫至2014年8月期間關(guān)于PLCE1蛋白表達(dá)與食管鱗癌相關(guān)性的文獻(xiàn),將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)按研究方法歸類整理原始數(shù)據(jù)匯總后進(jìn)行Meta分析和統(tǒng)計處理,分析評價PLCE1蛋白與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。(3)用PLCE1特異性的siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞系,運用MTT法檢測細(xì)胞生長情況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化,檢測不同處理對凋亡和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)影響;利用transwell小室侵襲實驗檢測不同處理下食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力及對上皮間葉轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)影響,應(yīng)用免疫熒光檢測不同處理組細(xì)胞的形態(tài)和骨架蛋白F-actin的表達(dá)變化情況；應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞儀觀察并檢測iTNF-α、 TRAIL、Paclitaxel、5-FU對沉默PLCE1基因后的食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制及凋亡的變化。(4)應(yīng)用人類表達(dá)譜芯片Affymetrix3'IVT對不同處理組細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析,篩選出差異表達(dá)基因,并利用生物信息學(xué)進(jìn)行GO分析和KEGG、PATHWAY分析。 結(jié)果：(1)PLCE1蛋白的表達(dá)主要位于食管鱗癌細(xì)胞的胞漿,正常組織、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、食管鱗癌組織中PLCE1蛋白的高表達(dá)率分別為2.03%(2/99)、58.33%(35/60)、72.50%(28/39)和73.22%(82/112),PLCE1蛋白在癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(免疫組化評分：6.768±0.2717vs1.707±0.1416,P0.001),高級別上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(免疫組化評分：7.103±0.4312vs1.707±0.1416,P0.001),低級別上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(免疫組化評分：6.333±0.3808vs1.707±0.1416,P0.001),鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于低級別上皮內(nèi)瘤變組織(免疫組化評分：6.768±0.2717vs6.333±0.3808,P=0.046)。(2)PLCE1蛋白表達(dá)與食管鱗癌發(fā)病性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化及浸潤深度等臨床病理特征沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.253,0.309,0.787,0.542,0.418,0.467),但其高表達(dá)與臨床TNM分期(P=0.024)及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(P=0.021)密切相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)PLCE1蛋白高表達(dá)與食管鱗癌患者生存時間明顯低于低表達(dá)患者(log-rank test, x2=10.243, P=0.001)。用Cox回歸模型進(jìn)行食管鱗癌預(yù)后因素篩選發(fā)現(xiàn),在包括年齡、性別、吸煙、腫瘤大小、組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的多因素分析中,PLCE1蛋白的表達(dá)(HR：8.435,95%CI=1.875-37.983,P=0.005)可以作為獨立因素影響食管鱗癌患者的預(yù)后因素。(3)在meta分析PLCE1表達(dá)與ESCC臨床病理關(guān)系的研究中,共納入4篇參考文獻(xiàn)(總計388例食管鱗癌患者,117例正常對照),結(jié)果顯示PLCE1表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展有密切關(guān)系(pooled OR=5.93;95%CI=3.86-9.11),而與腫瘤的浸潤深度(pooled OR=1.54;95%CI=0.84to2.82)、分化(pooled OR=1.55;95%CI=0.71-3.36)和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(pooled OR=2.83;95%CI=0.89-9.06)無明顯關(guān)聯(lián)(P0.05)。(4)轉(zhuǎn)染入PLCE1siRNA質(zhì)粒后,MTT和單克隆形成實驗顯示食管鱗癌細(xì)胞的生長受到明顯抑制、食管鱗癌細(xì)胞株的細(xì)胞團(tuán)數(shù)明顯減少,流式細(xì)胞實驗顯示經(jīng)過PLCE1siRNA轉(zhuǎn)染的食管鱗癌細(xì)胞株與對照組相比,早期和晚期凋亡的比率明顯升高(P0.05),食管鱗癌細(xì)胞株中凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved-PARP的表達(dá)量明顯增高。Transwell實驗顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染PLCE1siRNA質(zhì)粒的食管鱗癌細(xì)胞株的形態(tài)由原來的長梭形變?yōu)闄E圓形,其侵襲和遷移能力明顯降低;PLCE1基因被干擾后,其上皮的標(biāo)記物E-cadherin明顯升高,而間葉的標(biāo)記物Vimentin則明顯下降。免疫熒光實驗報告顯示干擾PLCE1表達(dá)后,細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)明顯降低。(5)PLCE.1基因被干擾后,食管鱗癌細(xì)胞經(jīng)TNF-α、TRAIL、 Paclitaxel、5-FU處理后,其細(xì)胞數(shù)量明顯減少,凋亡比例明顯增高�？梢�,PLCE1可增加食管鱗癌細(xì)胞對TNF-α、TRAIL、Paclitaxel和5-FU藥物的抵抗。(6)利用表達(dá)譜芯片篩選轉(zhuǎn)染PLCE1siRNA人食管鱗癌細(xì)胞前后的差異表達(dá)基因223個,其中上調(diào)基因168個,下調(diào)基因55個,這些基因主要涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白酶活性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等方面,涉及的通路有MAPK通路,粘著斑形成,Axon guidance, p53通路,Starch and sucrose metabolism, ECM-receptor interaction, Toll樣受體信號通路,D-Glutamine and D-glutamate metabolism, Cytokine-cytokine receptor interaction, Glutamate metabolism等。 結(jié)論：(1)PLCE1在食管鱗癌及癌前病變組織中的表達(dá)明顯高于正常組織的表達(dá),其高表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后差密切相關(guān)且是影響食管鱗癌患者預(yù)后的獨立因素：(2) PLCE1不但可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡,還可以增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞對細(xì)胞因子和化療藥物的耐藥性,且其可以通過影響骨架蛋白表達(dá)及上皮間葉轉(zhuǎn)化來調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 第二部分食管鱗癌中PLCE1相關(guān)miRNA互相調(diào)控機(jī)制初步研究 目的：(1)闡明miR-145靶向調(diào)控PLCE1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；(2)篩選并探討PLCE1在食管鱗癌中可以調(diào)控的miRNA及其下游靶基因在食管鱗癌發(fā)生中的作用機(jī)制。 方法：(1)運用生物信息學(xué)預(yù)測可能靶向調(diào)控PLCE1的miRNAs,應(yīng)用熒光素酶報告實驗驗證PLCE1是miR-145的靶基因,觀察miR-145通過調(diào)控PLCE1對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,應(yīng)用實時定量PCR檢測食管鱗癌組織及其正常食管組織中miR-145和PLCE1的表達(dá)情況,分析它們之間的相關(guān)性。(2)運用Affymetrix GeneChip miRNA3.0Arrays芯片來篩選PLCE1基因可能調(diào)控的下游miRNAs分子并進(jìn)行驗證。(3)對驗證得出的miR-106b分子在食管鱗癌細(xì)胞中進(jìn)行生物功能學(xué)的研究;應(yīng)用熒光素酶報告實驗驗證RBL1和RBL2是miR-106b的靶基因；觀察PLCE1通過調(diào)控miR-106b以及靶基因進(jìn)而對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。(4)應(yīng)用實時定量PCR檢測食管鱗癌組織和正常食管組織中miR-106b的表達(dá),應(yīng)用免疫組化檢測368例食管鱗癌組織和215例正常食管組織中RBL2蛋白的表達(dá)情況,并聯(lián)合分析PLCE1蛋白、miR-106b和RBL2蛋白表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果：(1)運用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行對可能靶向調(diào)控PLCE1基因的miRNAs進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miR-145為三個軟件共同預(yù)測的分子。通過在食管鱗癌細(xì)胞系中檢測兩者的表達(dá)情況,初步確認(rèn)PLCE1與miR-145可能存在一定的負(fù)向調(diào)控關(guān)系。通過轉(zhuǎn)染miR-145mimcs和inhibitor對PLCE1表達(dá)的調(diào)控作用以及應(yīng)用熒光素酶報告實驗,發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細(xì)胞系中miR-145可靶向調(diào)控PLCE1的表達(dá)。(2)miR-145可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡,并可通過調(diào)控細(xì)胞的骨架從而抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力,增強(qiáng)miR-145表達(dá)且轉(zhuǎn)染PLCE1siRNA介導(dǎo)的PLCE1基因沉默能更加顯著的降低食管鱗癌的增殖和侵襲能力。(3)與癌旁正常食管組織相比,miR-145在癌組織中表達(dá)顯著降低(癌組織41.92±9.089,正常組織104.4±13.00,P=0.0002),miR-145的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0：66.54±32.47,N1-3：25.89±9.95,P=0.0002)和臨床分期密切相關(guān)(T1/2：54.01±21.86,T3/4：31.03±15.77,P=0.0381)。食管鱗癌組織樣本中miR-145mRNA表達(dá)與PLCE1蛋白存在著明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.472,P=0.008)。(4)運用Afffymetrix GeneChip miRNA3.0Arrays芯片檢測PLCE1可能調(diào)控的miRNAs分子,我們發(fā)現(xiàn)miR-106b-5p和miR-93可被PLCE1顯著上調(diào)。通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)在沉默PLCE1后,miR-106b和miR-93表達(dá)顯著下調(diào),初步在食管鱗癌細(xì)胞中確認(rèn)PLCE1與miR-106b和miR-93存在顯著的正向調(diào)控關(guān)系。(5)miR-106b可顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移,抑制食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。初步驗證得出RBL2和RBL1為miR-106b的靶基因。增強(qiáng)miR-106b表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)siRNA介導(dǎo)的PLCE1基因沉默導(dǎo)致的食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲能力降低,并且也部分逆轉(zhuǎn)PLCE1基因沉默導(dǎo)致的食管鱗癌細(xì)胞凋亡增加。(6)與正常食管組織相比,miR-106b-5p在癌組織中表達(dá)顯著增高(P=0.0211),RBL2在癌組織中表達(dá)顯著降低(P0.0001)。食管鱗癌組織樣本中PLCE1蛋白表達(dá)與miR-106b表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系(R=0.4814,P=0.0431),食管鱗癌組織樣本中PLCE1蛋白表達(dá)與RBL2蛋白表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(R=-0.2934,P=0.0015),食管鱗癌組織樣本中miR-106b表達(dá)與RBL2蛋白表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(R=-0.6143,P=0.0014)。 結(jié)論：(1)miR-145通過負(fù)性調(diào)節(jié)PLCE1表達(dá)而抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲。(2)PLCE1基因可通過顯著上調(diào)miR-106b表達(dá)而促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖和遷移并抑制凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

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本文編號：2486914