【摘要】：背景食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是河南省常見腫瘤,具有較強(qiáng)的侵略性和較差的預(yù)后,在臨床回顧性研究中是僅次于胃癌的致死腫瘤。輔助治療,化療、放療和內(nèi)鏡治療沒有改善晚期食管癌患者的存活率。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,血管生成是腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,為腫瘤生長及擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移提供豐富的營養(yǎng)。多種血管生成相關(guān)因子參與腫瘤血管生成的過程。研究最為廣泛、深入的因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR),特別是Flt-1與KDR,調(diào)控著腫瘤新生血管的生成,并且促進(jìn)了多種惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移[1-3]。除此之外還有促血管生成素(angiopoietins,Ang)及其受體Tie-2構(gòu)成的Ang/Tie-2信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在血管生成中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。全反式維甲酸(ATRA)是維生素A的活性成分,影響涉及較為廣泛的生物學(xué)過程,包括生長、增殖、神經(jīng)功能、免疫功能、生殖等。它是最有效的、重要的誘導(dǎo)分化劑,尤其是在急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床治療當(dāng)中發(fā)揮重要作用。ATRA在幾個(gè)腫瘤血管生成模型里都有抑制轉(zhuǎn)移的潛力。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察ATRA通過維甲酸受體(RAR)對(duì)食管癌細(xì)胞系EC1中Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGF受體VEGFR(Flt-1,KDR)蛋白水平和mRNA水平表達(dá)的影響,為ATRA在食管鱗癌抗血管生成的治療中提供理論依據(jù)。目的探究不同濃度的ATRA對(duì)體內(nèi)外食管鱗癌細(xì)胞系EC1的增殖、遷移活力的影響,對(duì)EC1中血管生成相關(guān)因子Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGFR(Flt-1和KDR)mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響。方法終濃度分別為0、0.1、1、10μmol/L的ATRA,10μmol/L的AM80以及濃度為100mg/L的氟尿嘧啶作用于體外的人食管鱗癌EC1細(xì)胞,并且采用CCK-8法評(píng)價(jià)ATRA對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞活力的抑制情況,并證實(shí)ATRA可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路激活Caspase3、Cl-caspase3,PARP、Cl-PARP等,從而殺傷細(xì)胞;通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATRA對(duì)于EC1作用24h前后的細(xì)胞遷移能力的抑制作用;采用蛋白印跡法(western blot)和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分別檢測(cè)不同濃度ATRA作用于EC1 24h后Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGFR(Flt-1和KDR)蛋白和m RNA水平的表達(dá)情況。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將處于對(duì)數(shù)生長期的EC1細(xì)胞種植于裸鼠肩胛區(qū),監(jiān)測(cè)裸鼠荷瘤后給藥對(duì)體重及腫瘤大小的影響;用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)EC1形成的瘤體組織內(nèi)Ang-1,Ang-2,Tie-2和CD31的表達(dá),從而評(píng)價(jià)ATRA對(duì)腫瘤血管生成的影響。結(jié)果1.CCK-8結(jié)果:作用于24h后,實(shí)驗(yàn)組,即0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil組相對(duì)于對(duì)照組的增殖抑制率分別為:13.7%、22.0%、29.5%、29.9%;48h后,上述實(shí)驗(yàn)組的增殖抑制率分別為:24.2%、33.9%、40.3%、41.2%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ATRA處理組之間進(jìn)行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:作用于24h后,實(shí)驗(yàn)組,即0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil組相對(duì)于0h的細(xì)胞的遷移率分別為15.8%、43.3%、87.1%、96.9%。ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ATRA處理組之間進(jìn)行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.PCR結(jié)果:與對(duì)照組相比,0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100mg/L Fluorouracil組作用于EC1細(xì)胞48h后,Ang-1的mRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后,均有不同程度降低,抑制率依次為:52%、69%、80%、73%(Fig 3B).Ang-2的mRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后,均有不同程度降低,抑制率依次為:30%、55%、69%、66%.Tie-2的mRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后,均有不同程度降低,抑制率依次為:27%、76%、94%、94%(Fig 3B).可以看出,隨著藥物濃度的增加,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表達(dá)量均有下降趨勢(shì),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ATRA處理組之間進(jìn)行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Western blot結(jié)果:0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil作用于EC1細(xì)胞48h后,Ang-1,Ang-2和tie-2的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均有不同程度下降。Ang-1的表達(dá)抑制率分別為36%、40%、35%、87%(Fig 4C).Ang-2的表達(dá)抑制率分別為36%、40%、35%、87%(Fig 4D).Tie-2的相對(duì)表達(dá)抑制率為15%、6%、22%、68%.可以看出,隨著藥物濃度的增加,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表達(dá)量均有下降趨勢(shì),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ATRA處理組之間進(jìn)行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在第0天,將1x106個(gè)EC1細(xì)胞接種到裸鼠肩胛部分皮下。荷瘤10天后,將可見瘤體的裸鼠隨機(jī)分為4組,1組為安慰劑組,3組分別灌胃ATRA(0.1,1,和10 mg/kg/day)。在荷瘤20天后處死裸鼠。荷瘤前后,藥物處理前后測(cè)量并記錄裸鼠重量。根據(jù)裸鼠體重判斷其惡病質(zhì)狀態(tài),觀察到ATRA處理組可以減輕惡病質(zhì)狀態(tài)。將各處理組的瘤體組織剝離并按組排序,并進(jìn)行拍照。腫瘤大小計(jì)算:寬×長度。計(jì)算各處理組中裸鼠瘤體大小。用免疫組織化學(xué)法測(cè)量皮下瘤體組織的CD31,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表達(dá)水平�？梢园l(fā)現(xiàn)ATRA抑制荷瘤裸鼠上EC1瘤體的增長,并且改善荷瘤裸鼠的惡病質(zhì)狀態(tài)。結(jié)論1、ATRA能通過激活食管鱗癌細(xì)胞系EC1細(xì)胞的凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且抑制細(xì)胞增殖,并且ATRA的殺傷細(xì)胞作用具有劑量和時(shí)間依賴性。2、ATRA可以抑制EC1細(xì)胞的遷移,抑制Ang-1、Ang-2、Tie-2,VEGF和VEGFR的mRNA和蛋白的表達(dá),并且具有劑量和時(shí)間增效效應(yīng)。3、ATRA可能通過下調(diào)Ang-1;Ang-2;Tie-2、VEGF、Flt-1和KDR等基因的表達(dá)水平,影響食管癌細(xì)胞學(xué)EC1細(xì)胞中新生血管的生成,從而抑制腫瘤的生長。4、ATRA抑制荷瘤裸鼠上EC1瘤體的增長,并且改善荷瘤裸鼠的惡病質(zhì)狀態(tài)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2482907