【摘要】：背景食管鱗狀細胞癌(ESCC)是河南省常見腫瘤,具有較強的侵略性和較差的預后,在臨床回顧性研究中是僅次于胃癌的致死腫瘤。輔助治療,化療、放療和內(nèi)鏡治療沒有改善晚期食管癌患者的存活率。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,血管生成是腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移的關鍵步驟,為腫瘤生長及擴散、轉(zhuǎn)移提供豐富的營養(yǎng)。多種血管生成相關因子參與腫瘤血管生成的過程。研究最為廣泛、深入的因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR),特別是Flt-1與KDR,調(diào)控著腫瘤新生血管的生成,并且促進了多種惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移[1-3]。除此之外還有促血管生成素(angiopoietins,Ang)及其受體Tie-2構(gòu)成的Ang/Tie-2信號傳導系統(tǒng)在血管生成中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。全反式維甲酸(ATRA)是維生素A的活性成分,影響涉及較為廣泛的生物學過程,包括生長、增殖、神經(jīng)功能、免疫功能、生殖等。它是最有效的、重要的誘導分化劑,尤其是在急性早幼粒細胞白血病的臨床治療當中發(fā)揮重要作用。ATRA在幾個腫瘤血管生成模型里都有抑制轉(zhuǎn)移的潛力。本研究通過體內(nèi)外實驗觀察ATRA通過維甲酸受體(RAR)對食管癌細胞系EC1中Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGF受體VEGFR(Flt-1,KDR)蛋白水平和mRNA水平表達的影響,為ATRA在食管鱗癌抗血管生成的治療中提供理論依據(jù)。目的探究不同濃度的ATRA對體內(nèi)外食管鱗癌細胞系EC1的增殖、遷移活力的影響,對EC1中血管生成相關因子Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGFR(Flt-1和KDR)mRNA及蛋白水平表達的影響。方法終濃度分別為0、0.1、1、10μmol/L的ATRA,10μmol/L的AM80以及濃度為100mg/L的氟尿嘧啶作用于體外的人食管鱗癌EC1細胞,并且采用CCK-8法評價ATRA對食管鱗癌細胞的增殖及細胞活力的抑制情況,并證實ATRA可以通過誘導細胞的凋亡信號通路激活Caspase3、Cl-caspase3,PARP、Cl-PARP等,從而殺傷細胞;通過劃痕實驗檢測ATRA對于EC1作用24h前后的細胞遷移能力的抑制作用;采用蛋白印跡法(western blot)和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合鏈式反應(RT-PCR)分別檢測不同濃度ATRA作用于EC1 24h后Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGFR(Flt-1和KDR)蛋白和m RNA水平的表達情況。在體內(nèi)實驗中,將處于對數(shù)生長期的EC1細胞種植于裸鼠肩胛區(qū),監(jiān)測裸鼠荷瘤后給藥對體重及腫瘤大小的影響;用免疫組織化學法檢測EC1形成的瘤體組織內(nèi)Ang-1,Ang-2,Tie-2和CD31的表達,從而評價ATRA對腫瘤血管生成的影響。結(jié)果1.CCK-8結(jié)果:作用于24h后,實驗組,即0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil組相對于對照組的增殖抑制率分別為:13.7%、22.0%、29.5%、29.9%;48h后,上述實驗組的增殖抑制率分別為:24.2%、33.9%、40.3%、41.2%。經(jīng)統(tǒng)計學分析,ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ATRA處理組之間進行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.細胞劃痕實驗結(jié)果:作用于24h后,實驗組,即0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil組相對于0h的細胞的遷移率分別為15.8%、43.3%、87.1%、96.9%。ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ATRA處理組之間進行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.PCR結(jié)果:與對照組相比,0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100mg/L Fluorouracil組作用于EC1細胞48h后,Ang-1的mRNA表達量標準化后,均有不同程度降低,抑制率依次為:52%、69%、80%、73%(Fig 3B).Ang-2的mRNA表達量標準化后,均有不同程度降低,抑制率依次為:30%、55%、69%、66%.Tie-2的mRNA表達量標準化后,均有不同程度降低,抑制率依次為:27%、76%、94%、94%(Fig 3B).可以看出,隨著藥物濃度的增加,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表達量均有下降趨勢,經(jīng)統(tǒng)計學分析,ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ATRA處理組之間進行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.Western blot結(jié)果:0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil作用于EC1細胞48h后,Ang-1,Ang-2和tie-2的蛋白表達量與對照組相比均有不同程度下降。Ang-1的表達抑制率分別為36%、40%、35%、87%(Fig 4C).Ang-2的表達抑制率分別為36%、40%、35%、87%(Fig 4D).Tie-2的相對表達抑制率為15%、6%、22%、68%.可以看出,隨著藥物濃度的增加,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表達量均有下降趨勢,經(jīng)統(tǒng)計學分析,ATRA及氟尿嘧啶處理組分別與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ATRA處理組之間進行兩兩比較,差異也具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.體內(nèi)實驗結(jié)果:在第0天,將1x106個EC1細胞接種到裸鼠肩胛部分皮下。荷瘤10天后,將可見瘤體的裸鼠隨機分為4組,1組為安慰劑組,3組分別灌胃ATRA(0.1,1,和10 mg/kg/day)。在荷瘤20天后處死裸鼠。荷瘤前后,藥物處理前后測量并記錄裸鼠重量。根據(jù)裸鼠體重判斷其惡病質(zhì)狀態(tài),觀察到ATRA處理組可以減輕惡病質(zhì)狀態(tài)。將各處理組的瘤體組織剝離并按組排序,并進行拍照。腫瘤大小計算:寬×長度。計算各處理組中裸鼠瘤體大小。用免疫組織化學法測量皮下瘤體組織的CD31,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表達水平�？梢园l(fā)現(xiàn)ATRA抑制荷瘤裸鼠上EC1瘤體的增長,并且改善荷瘤裸鼠的惡病質(zhì)狀態(tài)。結(jié)論1、ATRA能通過激活食管鱗癌細胞系EC1細胞的凋亡通路誘導細胞凋亡,并且抑制細胞增殖,并且ATRA的殺傷細胞作用具有劑量和時間依賴性。2、ATRA可以抑制EC1細胞的遷移,抑制Ang-1、Ang-2、Tie-2,VEGF和VEGFR的mRNA和蛋白的表達,并且具有劑量和時間增效效應。3、ATRA可能通過下調(diào)Ang-1;Ang-2;Tie-2、VEGF、Flt-1和KDR等基因的表達水平,影響食管癌細胞學EC1細胞中新生血管的生成,從而抑制腫瘤的生長。4、ATRA抑制荷瘤裸鼠上EC1瘤體的增長,并且改善荷瘤裸鼠的惡病質(zhì)狀態(tài)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

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本文編號：2482907