【摘要】：目的:本課題組前期相關(guān)研究證實(shí),在體內(nèi)外二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)均能呈劑量依賴(lài)性發(fā)揮調(diào)控作用,抑制人白血病HL-60細(xì)胞增殖遷移侵襲和誘導(dǎo)分化。最新的相關(guān)蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),DADS可在多種腫瘤細(xì)胞中調(diào)控RhoGDI2蛋白低表達(dá)。本研究依據(jù)課題組前期相關(guān)研究取得的結(jié)論,通過(guò)構(gòu)建RhoGDI2高表達(dá)的人白血病HL-60細(xì)胞系,探討DADS對(duì)RhoGDI2高表達(dá)HL-60細(xì)胞分化的影響。方法:將pIRES2-EGFP-RhoGDI2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人白血病HL-60細(xì)胞,構(gòu)建RhoGDI2穩(wěn)定高表達(dá)HL-60細(xì)胞系。運(yùn)用CCK-8試驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、NBT及免疫熒光試驗(yàn)觀察DADS對(duì)RhoGDI2高表達(dá)HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期及分化等生物學(xué)行為的影響。Western blot檢測(cè)DADS對(duì)RhoGDI2高表達(dá)HL-60細(xì)胞Rac1/Pak1/LIMK1信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.成功構(gòu)建RhoGDI2穩(wěn)定高表達(dá)的HL-60細(xì)胞系。將經(jīng)過(guò)G418篩選2周培養(yǎng)獲得的高表達(dá)組與陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在免疫熒光顯微鏡下觀察均可見(jiàn)大量的綠色熒光。提取高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞蛋白,經(jīng)Western blot試驗(yàn)檢測(cè)及QT-PCR,結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組(RhoGDI2/HL-60)細(xì)胞中RhoGDI2蛋白表達(dá)及m RNA明顯增高(P0.05),且高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組中的表達(dá),提示成功獲得RhoGDI2穩(wěn)定高表達(dá)的HL-60細(xì)胞系。將上述高表達(dá)組與陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞送公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示,高表達(dá)組細(xì)胞中的質(zhì)粒p IRES2-EGFP-RhoGDI2的插入序列與RhoGDI2基因全長(zhǎng)c DNA的Gen Bank序列完全一致。證實(shí)成功獲得RhoGDI2穩(wěn)定高表達(dá)的HL-60細(xì)胞系。2.DADS對(duì)RhoGDI2穩(wěn)定高表達(dá)HL-60細(xì)胞生物學(xué)行為的影響2.1 DADS對(duì)RhoGDI2穩(wěn)定高表達(dá)HL-60細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示,DADS處理24小時(shí)后,高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力較未處理前相比均明顯減弱,并且DADS對(duì)陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制效果較高表達(dá)組更顯著(P0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)DADS處理和經(jīng)ATRA處理相關(guān)細(xì)胞處理組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示RhoGDI2蛋白穩(wěn)定高表達(dá)可降低DADS對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用。2.2 DADS對(duì)RhoGDI2高表達(dá)HL-60細(xì)胞遷移侵襲的影響Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DADS未處理前,高表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)(率)明顯高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05);而經(jīng)DADS處理24h后,高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組三組細(xì)胞的遷移能力均較未處理前明顯降低(P0.05),而DADS處理和ATRA處理相關(guān)細(xì)胞處理組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達(dá)可降低DADS對(duì)HL-60細(xì)胞的遷移抑制作用。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:DADS未處理前,高表達(dá)組細(xì)胞的穿膜數(shù)較陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組明顯增多(P0.05);DADS處理24h后,高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞較未處理組穿膜數(shù)較未處理前明顯降低(P0.05);而DADS處理和ATRA處理各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達(dá)可降低DADS對(duì)HL-60細(xì)胞的侵襲抑制作用。2.3 DADS對(duì)RhoGDI2高表達(dá)HL-60細(xì)胞分化的影響NBT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DADS未處理前,陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞還原率明顯高于高表達(dá)組(P0.05);而DADS處理24h后,高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組三組細(xì)胞對(duì)硝基藍(lán)四唑的還原能力均較未處理明顯增強(qiáng)(P0.05);DADS處理和ATRA處理相關(guān)各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達(dá)可降低DADS對(duì)HL-60細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DADS未處理前,高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表面的CD11b均呈弱表達(dá),高表達(dá)組CD33表達(dá)量明顯高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組;而經(jīng)DADS處理24h后,三組細(xì)胞表面的CD11b表達(dá)均較未處理時(shí)明顯增加,三組細(xì)胞表面的CD33表達(dá)均較未處理時(shí)明顯降低,且高表達(dá)組細(xì)胞表面CD33降低幅度較陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組少;DADS處理和ATRA處理相關(guān)各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達(dá)可降低DADS對(duì)HL-60細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。2.4 DADS對(duì)RhoGDI2高表達(dá)HL-60細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,DADS未處理前,高表達(dá)組細(xì)胞的S期/G1期細(xì)胞比率明顯高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05),提示RhoGDI2高表達(dá)可增強(qiáng)HL-60細(xì)胞的增殖作用。而經(jīng)DADS處理24h后,高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組三組細(xì)胞G1期細(xì)胞百分率均較未處理時(shí)明顯提高(P0.05),S期細(xì)胞百分率均明顯降低(P0.05),表明DADS處理后出現(xiàn)G1期細(xì)胞阻滯。3.DADS對(duì)RhoGDI2高表達(dá)HL-60細(xì)胞對(duì)Rac1/Pak1/LIMK1通路的影響Western blot結(jié)果顯示,RhoGDI2高表達(dá)可上調(diào)HL-60細(xì)胞Rac1、Pak1及LIMK1表達(dá)(P0.05)。DADS處理24h后,高表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RhoGDI2、Rac1、Pak1及LIMK1等蛋白的表達(dá)水平均較未處理時(shí)顯著下調(diào)(P0.05)。提示DADS可下調(diào)RhoGDI2調(diào)控Rac1/Pak1/LIMK1通路。結(jié)論:1.DADS可下調(diào)RhoGDI2調(diào)控Rac1/Pak1/LIMK1通路誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化。2.RhoGDI2高表達(dá)可增強(qiáng)HL-60細(xì)胞增殖與遷移侵襲和抑制分化。3.RhoGDI2高表達(dá)可削弱DADS對(duì)HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃衛(wèi)國(guó);譚暉;易嵐;何潔;蘇琦;;二烯丙基二硫上調(diào)p21、STAT1和CAMTA1誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞分化[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2010年04期

2 凌暉;陸麗峰;文玲;何潔;譚暉;夏紅;蘇琦;;RNA干擾Chk1/2調(diào)控二烯丙基二硫誘導(dǎo)的G2/M期阻滯作用及相關(guān)周期蛋白表達(dá)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2010年02期

3 易嵐;曾希;譚暉;葛玲;吉小霞;林敏;蘇琦;;二烯丙基二硫?qū)θ税籽L-60細(xì)胞凋亡啟動(dòng)過(guò)程的影響[J];癌癥;2009年01期

4 林敏;謝海龍;蘇琦;周建國(guó);譚暉;易嵐;唐海林;黃炎;石鶯;;二烯丙基二硫作用于HL-60細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)[J];癌癥;2007年04期

5 ;Diallyl disulfide suppresses growth of HL-60 cell through increasing his-tone acetylation and p21~(WAF1)expression in vivo and in vitro[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年11期

6 武明花,黃衛(wèi)國(guó),譚暉,何潔,蘇琦;DADS抑制JAK1/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞分化[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2005年05期

7 ;Diallyl disulfide-induced G2/M arrest of human gastric cancer MGC803 cells involves activation of p38 MAP kinase pathways[J];World Journal of Gastroenterology;2004年18期

8 何潔,萬(wàn)yN,黃衛(wèi)國(guó),劉瑤,趙潔,謝錦云,梁宋平,蘇琦;雙向電泳分析二烯丙基二硫誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化的蛋白表達(dá)差異[J];南華大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年02期

9 武明花,唐黎,李利平,黃衛(wèi)國(guó),蘇琦;二烯丙基二硫?qū)L-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)分化作用[J];中華血液學(xué)雜志;2004年05期

10 武明花,蘇琦,程愛(ài)蘭,譚暉,宋穎;二烯丙基二硫誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2003年03期

，

本文編號(hào)：2474144