【摘要】：目的:本課題組前期相關(guān)研究證實,在體內(nèi)外二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)均能呈劑量依賴性發(fā)揮調(diào)控作用,抑制人白血病HL-60細胞增殖遷移侵襲和誘導分化。最新的相關(guān)蛋白組學研究發(fā)現(xiàn),DADS可在多種腫瘤細胞中調(diào)控RhoGDI2蛋白低表達。本研究依據(jù)課題組前期相關(guān)研究取得的結(jié)論,通過構(gòu)建RhoGDI2高表達的人白血病HL-60細胞系,探討DADS對RhoGDI2高表達HL-60細胞分化的影響。方法:將pIRES2-EGFP-RhoGDI2真核表達載體轉(zhuǎn)染人白血病HL-60細胞,構(gòu)建RhoGDI2穩(wěn)定高表達HL-60細胞系。運用CCK-8試驗、細胞遷移實驗、Transwell侵襲實驗、流式細胞術(shù)、NBT及免疫熒光試驗觀察DADS對RhoGDI2高表達HL-60細胞增殖、遷移、侵襲、細胞周期及分化等生物學行為的影響。Western blot檢測DADS對RhoGDI2高表達HL-60細胞Rac1/Pak1/LIMK1信號通路調(diào)控相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果:1.成功構(gòu)建RhoGDI2穩(wěn)定高表達的HL-60細胞系。將經(jīng)過G418篩選2周培養(yǎng)獲得的高表達組與陰性轉(zhuǎn)染組細胞在免疫熒光顯微鏡下觀察均可見大量的綠色熒光。提取高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的細胞蛋白,經(jīng)Western blot試驗檢測及QT-PCR,結(jié)果顯示:實驗組(RhoGDI2/HL-60)細胞中RhoGDI2蛋白表達及m RNA明顯增高(P0.05),且高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組中的表達,提示成功獲得RhoGDI2穩(wěn)定高表達的HL-60細胞系。將上述高表達組與陰性轉(zhuǎn)染組細胞送公司測序,測序結(jié)果顯示,高表達組細胞中的質(zhì)粒p IRES2-EGFP-RhoGDI2的插入序列與RhoGDI2基因全長c DNA的Gen Bank序列完全一致。證實成功獲得RhoGDI2穩(wěn)定高表達的HL-60細胞系。2.DADS對RhoGDI2穩(wěn)定高表達HL-60細胞生物學行為的影響2.1 DADS對RhoGDI2穩(wěn)定高表達HL-60細胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示,DADS處理24小時后,高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力較未處理前相比均明顯減弱,并且DADS對陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的細胞增殖抑制效果較高表達組更顯著(P0.05)。同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)DADS處理和經(jīng)ATRA處理相關(guān)細胞處理組之間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示RhoGDI2蛋白穩(wěn)定高表達可降低DADS對HL-60細胞的增殖抑制作用。2.2 DADS對RhoGDI2高表達HL-60細胞遷移侵襲的影響Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,DADS未處理前,高表達組細胞遷移數(shù)(率)明顯高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05);而經(jīng)DADS處理24h后,高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組三組細胞的遷移能力均較未處理前明顯降低(P0.05),而DADS處理和ATRA處理相關(guān)細胞處理組之間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達可降低DADS對HL-60細胞的遷移抑制作用。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:DADS未處理前,高表達組細胞的穿膜數(shù)較陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組明顯增多(P0.05);DADS處理24h后,高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞的細胞較未處理組穿膜數(shù)較未處理前明顯降低(P0.05);而DADS處理和ATRA處理各組之間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達可降低DADS對HL-60細胞的侵襲抑制作用。2.3 DADS對RhoGDI2高表達HL-60細胞分化的影響NBT實驗結(jié)果顯示,DADS未處理前,陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞還原率明顯高于高表達組(P0.05);而DADS處理24h后,高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組三組細胞對硝基藍四唑的還原能力均較未處理明顯增強(P0.05);DADS處理和ATRA處理相關(guān)各組之間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達可降低DADS對HL-60細胞的誘導分化作用。細胞免疫熒光實驗結(jié)果顯示,DADS未處理前,高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞表面的CD11b均呈弱表達,高表達組CD33表達量明顯高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組;而經(jīng)DADS處理24h后,三組細胞表面的CD11b表達均較未處理時明顯增加,三組細胞表面的CD33表達均較未處理時明顯降低,且高表達組細胞表面CD33降低幅度較陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組少;DADS處理和ATRA處理相關(guān)各組之間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示RhoGDI2高表達可降低DADS對HL-60細胞的誘導分化作用。2.4 DADS對RhoGDI2高表達HL-60細胞周期的影響流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,DADS未處理前,高表達組細胞的S期/G1期細胞比率明顯高于陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05),提示RhoGDI2高表達可增強HL-60細胞的增殖作用。而經(jīng)DADS處理24h后,高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組三組細胞G1期細胞百分率均較未處理時明顯提高(P0.05),S期細胞百分率均明顯降低(P0.05),表明DADS處理后出現(xiàn)G1期細胞阻滯。3.DADS對RhoGDI2高表達HL-60細胞對Rac1/Pak1/LIMK1通路的影響Western blot結(jié)果顯示,RhoGDI2高表達可上調(diào)HL-60細胞Rac1、Pak1及LIMK1表達(P0.05)。DADS處理24h后,高表達組、陰性轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞RhoGDI2、Rac1、Pak1及LIMK1等蛋白的表達水平均較未處理時顯著下調(diào)(P0.05)。提示DADS可下調(diào)RhoGDI2調(diào)控Rac1/Pak1/LIMK1通路。結(jié)論:1.DADS可下調(diào)RhoGDI2調(diào)控Rac1/Pak1/LIMK1通路誘導HL-60細胞分化。2.RhoGDI2高表達可增強HL-60細胞增殖與遷移侵襲和抑制分化。3.RhoGDI2高表達可削弱DADS對HL-60細胞誘導分化作用。
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【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

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本文編號：2474144