【摘要】：肝癌是一種死亡率較高、嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。慢性病毒感染、代謝異常以及毒性攝入等都是肝癌發(fā)生的重要原因。肝癌的發(fā)生除了與肝實質細胞本身的基因突變有關之外,與所處的免疫微環(huán)境關系密切,包括腫瘤局部的細胞因子、趨化因子等蛋白的表達變化,抑制性免疫細胞(包括調節(jié)性T細胞,M2型巨噬細胞或是髓系來源的抑制性細胞)的浸潤和抗腫瘤細胞(NK細胞,CD8+T細胞)的耗竭等諸多方面。抑制性細胞因子IL-10, TGF-β等上調表達以及免疫抑制細胞的聚集是腫瘤發(fā)生時普遍存在的現(xiàn)象,也成為腫瘤免疫治療的關鍵干預靶點。 Toll樣家族分子在腫瘤進程中的作用已經多有報道,不同的TLR分子可能發(fā)揮不同的作用,探明不同的TLR分子在腫瘤發(fā)生中的作用對腫瘤治療具有重要意義。TLR7, TLR8, TLR9激動劑可以用于治療小鼠腫瘤,已經進入臨床研究階段。本研究中我們首次證明TLR2激動劑可以用于肝癌的治療。我們首先采用流式細胞術檢測了化學藥物誘發(fā)的肝癌中肝細胞上TLR2分子的表達；之后采用TLR2缺陷小鼠,通過組織染色、免疫組化以及熒光定量PCR等方法檢測了TLR2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達動力學；接著我們通過腫瘤判定,流式分析細胞亞群變化,免疫印跡等方法發(fā)現(xiàn)caspase-8-IL-18-MDSC軸的過度活化是TLR2缺陷鼠易感腫瘤的原因；同時采用IL-18過表達質粒注射、IL-18沉默、caspase-8干擾等技術,證明TLR2對caspase-8-IL-18軸的負調效應：最后激動劑活化TLR2,實現(xiàn)了對肝癌小鼠的免疫治療。 基于以上研究思路以及實驗方法,我們取得了以下實驗結果： 1.肝癌發(fā)生過程中TLR2分子表達下調和TLR2活化能夠抑制腫瘤生長 本研究建立小鼠自發(fā)肝癌模型來研究TLR2分子在肝癌發(fā)生中的作用。在化學藥物二乙基亞硝胺誘導8個月后所有小鼠均發(fā)生肝癌。通過流式細胞術以及蛋白質免疫印跡等方法,我們發(fā)現(xiàn)肝細胞上TLR2分子表達下調。同時我們采用TLR2激動劑Pam3CSK4進行DEN腫瘤模型小鼠TLR2信號的長期活化,發(fā)現(xiàn)TLR2分子活化后能夠減緩肝癌的發(fā)生。這些研究結果說明TLR2分子可能在肝癌發(fā)生中發(fā)揮作用。 2.TLR2缺陷鼠易感自發(fā)性肝癌 此后,我們引入TLR2缺陷小鼠進行DEN腫瘤模型的誘導。TLR2缺陷小鼠在誘導8個月以后能夠發(fā)生更加嚴重的腫瘤。組織病理學分析能夠看到更大的腫瘤區(qū)域,并且肝細胞表現(xiàn)更強的細胞增殖能力(PCNA+)。同時通過熒光定量PCR的方法能夠檢測到更多腫瘤指標甲胎蛋白(AFP)的表達,說明TLR2分子在小鼠自發(fā)肝癌中起保護作用。 3.TLR2缺陷鼠中免疫細胞處于耗竭狀態(tài) 我們同時檢測了腫瘤小鼠中免疫細胞的狀態(tài)。盡管T細胞在DEN誘導的肝癌模型中的作用在免疫缺陷鼠(Rag14-)中已得到確認,但是在TLR2缺陷鼠中所處狀態(tài)還不清楚。我們發(fā)現(xiàn),DEN處理后TLR2缺陷鼠肝臟以及脾臟CD8+T細胞高表達PD-1,同時產生TNF-a以及穿孔素的能力降低。這些結果說明TLR2缺陷鼠在DEN誘導后免疫細胞處于耗竭狀態(tài)。 4.TLR2缺陷小鼠經DEN誘導以后表達更多的髓系來源抑制樣細胞 小鼠經DEN誘導之后,單核樣MDSC (CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chigh)在TLR2缺陷小鼠各臟器中均表達升高。對單核樣MDSC進行時間動力學監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)在DEN誘導5月以后TLR2缺陷小鼠肝臟中MDSC明顯多于野生鼠。同時,TLR2缺陷鼠的肝臟中表達較高水平的iNOS,并且阻斷其表達后能夠恢復T細胞功能。此外,我們對來源于野生鼠以及TLR2缺陷小鼠的MDSC的功能進行了比較,發(fā)現(xiàn)兩者抑制T細胞增殖以及產生IFN-y的能力沒有區(qū)別,并且兩者活化表型相似。只有TLR2缺陷鼠的MDSC表達較高水平的ki-67,這些實驗結果說明來源于TLR2缺陷鼠的單核樣MDSC是通過增加MDSC的數(shù)量,進而產生大量的iNOS來發(fā)揮抑制T細胞功能的。 5.來源于肝細胞的IL-18能夠誘導髓系來源的抑制樣細胞產生 接下來,我們就對MDSC增多的機制進行了探索。首先,通過熒光定量PCR的方法,我們對多種細胞因子進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn)只有IL-18的]mRNA在TLR2缺陷鼠中是上調表達的。并且通過免疫組化以及蛋白質免疫印跡實驗可以看到IL-18主要是由肝實質細胞產生的。在TLR2缺陷鼠中觀察到IL-18與MDSC表達的正相關性,提示我們IL-18可能具有誘導MDSC的作用。為了驗證這一猜測,我們首先檢測了MDSC上IL-18受體的表達,發(fā)現(xiàn)DEN處理后單核樣MDSC上確實表達較高水平的IL-18受體。同時我們通過體外培養(yǎng)以及體內IL-18過表達實驗也證實了IL-18能夠誘導MDSC產生。 6.肝細胞特異性干擾IL-18能夠降低髓系來源的抑制樣細胞的聚集并減緩腫瘤的發(fā)生 我們進行了體內干擾實驗驗證IL-18對MDSC以及腫瘤發(fā)生的影響。當在腫瘤發(fā)生過程中使用高壓注射的方式干擾掉肝細胞中IL-18的表達以后,盡管在野生鼠中沒有看到腫瘤發(fā)生程度的區(qū)別,干擾IL-18的表達能夠明顯減輕TLR2缺陷小鼠的腫瘤發(fā)生程度,同時單核樣MDSC的細胞比例明顯下調,CD8’T細胞功能得到恢復。 7.TLR2缺陷鼠中IL-18的產生依賴于caspase-8 我們對TLR2分子調控IL-18的機制進行了探究。在DEN處理后,TLR2缺陷小鼠肝臟中表達更高水平的caspase-8,而當使用Pam3CSK4進行活化后caspase-8的表達降低,這就提示我們caspase-8可能與IL-18的產生有關。因此,我們構建了caspase-8的干擾質粒對肝細胞進行特異性干擾,結果發(fā)現(xiàn)在TLR2缺陷鼠中干擾caspase-8以后,血清ALT以及IL-18的表達水平明顯降低,說明TLR2分子調控IL-18的表達是通過caspase-8來完成的。 8.TLR2激動劑Pam3CSK4處理能夠降低髓系來源的抑制樣細胞聚集并且恢復 抗腫瘤免疫應答 根據之前的研究結果,我們發(fā)現(xiàn)TLR2激動劑能夠減緩腫瘤的發(fā)生。在本部分研究中,我們發(fā)現(xiàn)Pam3CSK4處理后能夠同時降低單核樣以及粒細胞樣MDSC的比例以及細胞絕對數(shù)。血清中IL-18的表達水平在TLR2活化后明顯降低。此外,我們發(fā)現(xiàn)TLR2激動劑處理后能夠明顯上調活化的CD8+T細胞的比例以及絕對數(shù)。同時,在抗腫瘤免疫中起重要作用的細胞因子的表達得到明顯恢復。這些結果說明TLR2激動劑能夠通過抑制IL-18-MDSC-CTL軸來減緩腫瘤的發(fā)生。 結論：我們的研究揭示了在肝癌發(fā)病過程中TLR2分子扮演的重要角色。TLR2分子缺失能夠加劇IL-18介導的免疫抑制,而TLR2活化則能夠逆轉這一機制并最終減緩腫瘤的發(fā)生。這一研究成果為肝癌的免疫治療提供了新的思路。
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【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 ;Expression and significance of intratumoral interleukin-12 and interleukin-18 in human gastric carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2007年11期

2 Hayato Nakagawa;Shin Maeda;;Inflammation-and stress-related signaling pathways in hepatocarcinogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2012年31期

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本文編號：2473955