【摘要】：目的本研究擬檢測(cè)RUNX3在食管癌患者腫瘤組織及相應(yīng)細(xì)胞系中的發(fā)達(dá),并探討其與患者臨床病例參數(shù)的相關(guān)性,同時(shí)分析RUNX3和Aktl表達(dá)的變化對(duì)順鉑作用后的食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,探究RUNX3逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)機(jī)制,旨在為食管癌的臨床診斷以及靶向治療提供可靠依據(jù)。方法(1)采集103例2009年1月～2012年1月期間就診于山東大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科行食管鱗狀細(xì)胞癌(Ⅱa-Ⅲb期)切除手術(shù)患者癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織,熒光定量PCR檢測(cè)RUNX3 mRNA表達(dá),免疫組化法檢測(cè)RUNX3和Aktl蛋白的表達(dá),分析RUNX3與患者化療耐藥和臨床病例資料的相關(guān)性,分析RUNX3與Aktl的相關(guān)性。(2)構(gòu)建攜帶有RUNX3全基因或siAktl'慢病毒載體,包裝出病毒后感染ESCC細(xì)胞系,熒光定量PCR和western blot檢測(cè)RUNX3的表達(dá)：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期：Hoechst染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；western blot檢測(cè)Akt1、p-Akt1、Bcl-2、Bcl-x1、 CyclinD1、P21、Bax蛋白的表達(dá)。(3)將ESCC細(xì)胞中表達(dá)RUNX3及相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)皮下注射裸鼠.隨后經(jīng)腹膜內(nèi)注射順鉑,比較各組小鼠的腫瘤大小抑制腫瘤抑制率：結(jié)果(1)一般資料分析結(jié)果表明,男性患者與女性患者相比,RUNX3的低表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在小于56歲的食管鱗狀細(xì)胞癌患者中,RUNX3的低表達(dá)率與大于56歲患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)：在腫瘤浸潤程度為T1-T2期的患者當(dāng)中,RUNX3呈低表達(dá)的患者比例明顯低于T3、T4期患者(P0.05)；在臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者當(dāng)中,RUNX3呈低表達(dá)的患者比例明顯低于Ⅲ~Ⅳ期患者(P0.05)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者當(dāng)中,RUNX3呈低表達(dá)的患者比例明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P0.05)。在化療敏感的食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織中RUNX3 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平明顯高于化療不敏感者(P0.05),在未接受轉(zhuǎn)助化療的患者其癌組織中RUNX3 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平明顯高于術(shù)前接受過輔助化療者(P0.05)。在RUNX3表達(dá)呈陽性的組織中,Aktl的表達(dá)量明顯降低(P0.05)；在RUNX3表達(dá)為陰性的組織甲.Aktl的表達(dá)量則明顯增高(P0.05); RUNX3和Aktl表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.296,p=0.00420.01)。(2)順鉑耐藥的Eca109和TE-1細(xì)胞中RUNX3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于非耐藥Eca109和TE-1細(xì)胞(P0.01)。Eca-109 PR R3和Eca-109 PR R3細(xì)胞中RUNX3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯高于Eca-109 PR vector和TE-1 PR vector細(xì)胞(P0.01)。隨著順鉑濃度的增大,Eca-109 PR vector組和Eca-109 PR R3組、TE-1 PR vector組和TE-1 PR R3組的細(xì)胞活性均逐漸降低,呈劑量依賴性,其中當(dāng)順鉑濃度為100μg/mL時(shí)細(xì)胞活性最低；Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組細(xì)胞各濃度時(shí)的活性明顯低于TE-1 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.05)。隨著順鉑作用時(shí)間的延長,Eca-109 PR vector組和Eca-109 PR R3組、TE-1 PR vector組和TE-1 PR R3組細(xì)胞的活性均逐漸增高,呈時(shí)間依賴性,其中當(dāng)順鉑作用后96 h時(shí)細(xì)胞活性最高：Eca-109 PR R3組各順鉑作用時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性明顯低于Eca-109 PR vector組(P0.05)。隨著順鉑作用時(shí)間的延長,Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組組細(xì)胞的活性均逐漸增高,呈時(shí)間依賴性,其中當(dāng)順鉑作用后96 h時(shí)細(xì)胞活性最高；Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組各順鉑作用時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性明顯低于TE-1 PR vector組和TE-1 PR vector (P0.05)。Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組細(xì)胞的IC50濃度明顯低于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.05)。Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.01)。Eca-109 PR R3組和TE-1 PR R3組細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)量明顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.01),G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯少于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.05)。隨著順鉑濃度的增大,Eca-109 PR vector組和Eca-109 PR siAktl組、TE-1 PR vector組和TF-1 PR siAkt1組的細(xì)胞活性均逐漸降低,呈劑量依賴性,其中當(dāng)順鉑濃度為10μg/mL對(duì)細(xì)胞活性最低；Eca-109 PR siAkt1組和TE-1 PR siAkt1組各濃度的細(xì)胞活性明顯低于Eca-109 PR vector和TE-1 PR vector (P0.05)。Eca-109 PR siAktl組和TE-1 PR siAktl組細(xì)胞的IC50濃度明顯低于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.05) Eca-109 PR siAkt1組和TE-1PR siAktl組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.01)。Eca-109 PR siAktl組和TE-1 PR siAktl組細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)量明顯高于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.01),G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯少于Eca-109 PR vector組和TE-1 PR vector組(P0.05)。Eca-109 PR R3和Eca-109 PR siAkt1組細(xì)胞中Akt1、 Bcl-2、Bcl-xl、CyclinDl蛋白的表達(dá)水平明顯低于Eca-109 PR vector和TE-1 PR vector組(P0.05)；而Eca-109 PR R3和Eca-109 PR siAktl組細(xì)胞中RUNX3、P21、Bax蛋白的表達(dá)水平則明顯高于Eca-109 PR vector和TE-1 PR vector組(P0.05)。(3) Eca-109 PR vector組和Eca-109 PR R3組裸鼠均成瘤,成瘤率為100%。在治療期間各組裸鼠腫瘤體積均隨著時(shí)間推移不新增大,但Eca-109 PRR3組裸鼠在第18天后各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積均明顯小于Eca-109 PR vector組(P0.05)。隨著時(shí)間推移,各組裸鼠腫瘤體積抑制率均逐漸增高,但Eca-109 PR R3組裸鼠在各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積抑制率均明顯大于Eca-109 PR vector組(P0.05)。結(jié)論RUNX3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)量降低可能是導(dǎo)致發(fā)生順鉑耐藥的原因之一,RUNX3能夠通過抑制Akt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)食管鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2467501