【摘要】：目的:觀察改變mi RNA-21表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)和遷移中的作用,并探討其分子機(jī)制。方法:第一部分利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建mi RNA-21過表達(dá)載體(命名為p-mi R-21);體外將p-mi R-21和前期構(gòu)建的pc DNA-6.2-mi RNA-21-ASOs(命名為p-mi R-21-ASOs)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞中;Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-21成熟體的表達(dá)水平,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6,以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表達(dá)變化;利用CCK-8和Scratch assay檢測(cè)改變mi R-21表達(dá)對(duì)人肺癌95D細(xì)胞體外增殖和遷移的影響;利用Transwell技術(shù)檢測(cè)95D細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化;最后利用Western blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)途徑,包括Akt/m TOR、Erk等途徑的傳遞改變。第二部分運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)初步篩選出mi R-21可能的候選靶分子;Real-time PCR檢測(cè)p-mi R-21-ASOs和p-mi R-21轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞后,候選靶分子的表達(dá)變化;Western blot技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)。利用RNAi技術(shù)合成mi R-21靶分子LEMD3的RNAi干擾序列(命名為si-LEMD3),體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞;Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中LEMD3的表達(dá)變化;CCK-8法和Scratch assay觀察干擾LEMD3表達(dá)后對(duì)95D細(xì)胞體外增殖和遷移的影響;克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成能力的改變;Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中生長(zhǎng)周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6,以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表達(dá)變化;最后,利用Western blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)途徑,包括Akt/m TOR、Erk等途徑的傳遞改變。隨后,將p-mi R-21-ASOs載體(4μg)和si-LEMD3干擾序列(50 n M)共轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞中;CCK-8法和Scratch assay法觀察人肺癌95D細(xì)胞體外增殖和遷移的影響;克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察95D細(xì)胞克隆形成能力的改變;Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中生長(zhǎng)周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4等的表達(dá)變化;最后,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)LEMD3蛋白、磷酸化Akt、磷酸化Erk以及總Akt、Erk蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:第一部分經(jīng)鑒定成功構(gòu)建mi RNA-21過表達(dá)載體p-mi R-21;與p-Cont對(duì)照組相比,p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中mi R-21的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05);且p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞數(shù)隨著劑量的增加逐漸減少(P0.05),而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組中腫瘤細(xì)胞數(shù)隨著劑量的增加逐漸增多(P0.05);與p-Cont組相比,p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯降低(P0.05),而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞則明顯增強(qiáng)(P0.05);與p-Cont對(duì)照組相比,p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)減少,而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的則增多(P0.05);與p-Cont對(duì)照組相比,p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)均顯著下調(diào)(P0.05),而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05),此外,p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin的表達(dá)上調(diào),MMP-2、MMP-9和CXCR4的表達(dá)均下調(diào)(P0.05),而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組中E-cadherin的表達(dá)下調(diào),MMP-2、MMP-9和CXCR4的表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05);p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)(P0.05),而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P0.05)。第二部分初步篩選出mi R-21的候選10個(gè)靶分子,p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中抑癌靶基因SOCS6、HBP1、PTEN、PDCD4、RECK、SPRY1、TIMP3明顯上調(diào)(P0.05),促癌靶基因TIAM1、PIK3R1、HIF1α明顯下調(diào)的(P0.05);與之相反,p-mi R-21轉(zhuǎn)染組中的這些抑癌靶基因是下調(diào)的(P0.05),而促癌靶基因均明顯上調(diào)(P0.05);結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,篩選出mi R-21可能的新候選靶分子LEMD3;與p-Cont組相比,p-mi R-21-ASOs轉(zhuǎn)染組LEMD3的表達(dá)均表達(dá)上調(diào)(P0.05);而p-mi R-21轉(zhuǎn)染組LEMD3的表達(dá)均表達(dá)下調(diào)(P0.05),提示LEMD3為mi R-21的新靶分子。si-LEMD3轉(zhuǎn)染組中的LEMD3 m RNA水平和蛋白表達(dá)均表達(dá)下調(diào)(P0.05),且細(xì)胞數(shù)較Control組明顯增加;與Control組相比,si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯增強(qiáng)(P0.05),且腫瘤細(xì)胞克隆形成能力明顯增加(P0.05);與Control對(duì)照組相比,si-LEMD3轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05),而腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子除E-cadherin的m RNA下調(diào)外,其余三個(gè)MMP-2、MMP-9和CXCR4的m RNA均表達(dá)上調(diào)(P0.05);與Control對(duì)照組相比,si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P0.05)。與p-mi R-21-ASOs+si-control對(duì)照組相比,p-mi R-21-ASOs和si-LEMD3共轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中LEMD3蛋白表達(dá)均明顯減少(P0.05);且細(xì)胞數(shù)顯著增多;與p-mi R-21-ASOs+si-control對(duì)照組相比,p-mi R-21-ASOs+si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖和遷移能力均顯著增強(qiáng)(P0.05),同時(shí)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力明顯增加(P0.05);與p-mi R-21-ASOs+si-cont對(duì)照組相比,p-mi R-21-ASOs+si-cont轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)均顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子除E-cadherin的m RNA均表達(dá)下調(diào),其余三個(gè)MMP-2、MMP-9和CXCR4的m RNA均表達(dá)上調(diào)(P0.05);與p-mi R-21-ASOs+si-control對(duì)照組相比,p-mi R-21-ASOs+si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:第一部分:改變mi R-21的表達(dá)可顯著影響人肺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)和遷移,提示mi R-21可能是人肺癌基因治療的潛在新靶標(biāo)之一。第二部分:mi R-21調(diào)控人肺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)與遷移的效應(yīng)與其靶分子LEMD3表達(dá)改變有關(guān),涉及Akt、Erk等相關(guān)信號(hào)途徑傳遞的變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2
【相似文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前10條
1 陸網(wǎng)坤;;綠茶提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞影響的初步探討[J];中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用;2008年03期
2 朱順飛;廖珍媛;胡燕;陳超;李永菊;劉思靜;羅軍敏;熊思東;徐林;;微小RNA-7過表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的影響[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年05期
3 陳清勇 ,錢利生,王彥刈,周建英,鄭筱祥;茶多酚對(duì)高轉(zhuǎn)移性人肺癌細(xì)胞間隙連接通訊功能的上調(diào)研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2003年04期
4 凌賢龍,陸應(yīng)麟,杜芝燕;線粒體DNA缺失對(duì)人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年14期
5 黃秀清;龍治濤;寧麗峰;孫玲玲;桑建利;;蛋白磷酸酶4在人肺癌細(xì)胞A549增殖中的功能分析[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2006年08期
6 劉桂芝;賴百塘;;重組腫瘤壞死因子對(duì)體外培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞的效應(yīng)[J];腫瘤防治研究;1990年02期
7 牟巨偉;張汝剛;程書鈞;;人肺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)及其應(yīng)用[J];中國(guó)腫瘤臨床;1992年04期
8 周中軍，林晨，陳鳳，魏慧娟，羅賢懋，李佩菌，，王越;人肺癌細(xì)胞阿霉素耐藥株的生物學(xué)特性（論著摘要）[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1994年05期
9 鄧衛(wèi)文,謝弘,ClaudiaSemino,GianniMelioli;快速反復(fù)洗脫人肺癌細(xì)胞表面腫瘤相關(guān)多肽[J];上海免疫學(xué)雜志;1997年01期
10 鈴木盛彥;鄧祟新;;人肺癌細(xì)胞培養(yǎng)株染色體的研究[J];錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1981年02期
相關(guān)會(huì)議論文 前10條
1 張志謙;胡穎;林仲翔;;人肺癌細(xì)胞與人胚肺成纖維細(xì)胞間隙連接通訊的不對(duì)稱性[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)、免疫細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2002年
2 王建清;馬林;姜成梁;;人肺癌細(xì)胞在器官培養(yǎng)中侵襲特性的形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[A];第四次全國(guó)電子顯微學(xué)會(huì)議論文摘要集[C];1986年
3 閻春紅;陶祥;楊惠玲;謝彥;夏云飛;王欣;郭禹標(biāo);蘇勇;鄭芹;;二甲氧雌二醇對(duì)人肺癌細(xì)胞放射增敏作用的研究[A];2008年中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)第十一屆腫瘤和第十二屆免疫專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年
4 吳曉娜;黃承鈺;何濤;孫愛民;;維生素B_1、C和鮮桔汁對(duì)人肺癌細(xì)胞YTMLC-90生長(zhǎng)的影響[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2000年
5 吳國(guó)明;黃桂君;錢桂生;;人肺癌細(xì)胞NHE-1基因片段的克隆及其反義表達(dá)載體的構(gòu)建[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年
6 戰(zhàn)忠利;孫慧;閆慶娜;張連郁;白景文;楊海賢;;人肺癌細(xì)胞LALU血管生成過程的形態(tài)學(xué)及電鏡觀察意義[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年
7 李印;周清華;孫之琳;孫澤芳;朱大興;馬力;朱文;陳曉禾;;Nm23-H1基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺癌細(xì)胞中Ras-to-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國(guó)胸心血管外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集（胸外科分冊(cè)）[C];2006年
8 楊鴻生;尹德剛;李文輝;鄧勇軍;;NP方案同期放療對(duì)人肺癌細(xì)胞GLC凋亡率的影響[A];2005年浙江省腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議全國(guó)大腸癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的診治研討會(huì)學(xué)術(shù)論文集[C];2005年
9 況煒;陳慧玲;;鐵對(duì)人肺癌細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞模型增殖活性的影響[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第23屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要文集[C];2010年
10 連海;金寧一;李霄;陳立剛;張靜敏;管國(guó)芳;孫麗麗;李雪梅;鄭洪玲;;雞貧血病毒VP3基因誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞SPC-A1凋亡的作用機(jī)制[A];第九屆全國(guó)腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年
相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條
1 童暢;尿激酶型纖溶酶原激活物在人肺癌細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年
2 李印;nm23-H1基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺癌細(xì)胞中Ras-to-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2004年
3 李俊剛;亞硒酸鈉和酵母硒在豬組織中的代謝及其代謝產(chǎn)物對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年
4 張洪濤;外源Wtp53表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞藥物敏感性影響及相關(guān)基因克隆[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2000年
5 劉懿;RNA干擾抑制人肺癌細(xì)胞HMGB1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年
相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條
1 李瑾;5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)牛胎兒成纖維細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞A549的影響及作用機(jī)理的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年
2 蘆彥蓉;CRISPR/Cas9介導(dǎo)的SMYD3基因敲除對(duì)人肺癌細(xì)胞的影響研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2016年
3 李萌萌;清熱化痰散結(jié)方及其拆方抑制人肺癌細(xì)胞SK-MES和NCI-H69 PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究[D];河南中醫(yī)藥大學(xué);2016年
4 鄭文;改變microRNA-21的表達(dá)在人肺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)和遷移中的作用研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2017年
5 王天立;激發(fā)CD40信號(hào)對(duì)人肺癌細(xì)胞的生物學(xué)作用及其機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2004年
6 闞兵;抗人肺癌單克隆抗體的制備及其生物特性的研究[D];四川大學(xué);2006年
7 王哲;Nm23-H1基因?qū)θ朔伟┘?xì)胞骨架和生物學(xué)行為的影響[D];四川大學(xué);2003年
8 王愛麗;ATPR對(duì)人肺癌細(xì)胞分化和增殖的影響及其作用機(jī)制的初步探討[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年
9 倪娜娜;人肺癌細(xì)胞中microRNA let-7a-1/7f-1啟動(dòng)子的克隆及其功能的初步分析[D];山東大學(xué);2012年
10 何偉剛;TLR4信號(hào)通路參與人肺癌細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2006年
本文編號(hào)：
2463972
