【摘要】：目的:1.檢測Testin基因在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織的表達(dá)情況。2.檢測Testin基因在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞系的表達(dá)情況。3.研究Testin基因在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。4.通過構(gòu)建針對Testin基因的過表達(dá)載體,利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將Testin過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染不同的肺癌細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定Testin基因過表達(dá)肺癌細(xì)胞株,進(jìn)而通過細(xì)胞實驗研究Testin基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖、侵襲、克隆、凋亡、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行的影響。方法:1.檢測Testin基因在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá):收集并保存非小細(xì)胞肺癌患者(N=30)的非小細(xì)胞肺癌組織及對照的癌旁正常組織,用半定量PCR、western blot和免疫組化檢測Testin在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá);分析Testin基因表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理的關(guān)系,為臨床診斷、治療提供理論基礎(chǔ)。2.檢測Testin基因在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549、LTEP-a-2、NCI-H1650)及人支氣管上皮細(xì)胞16HBE中表達(dá)差異,培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系,用半定量PCR、Western blot檢測Testin基因在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá);3.Testin基因功能的初步研究:構(gòu)建Testin真核慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549、NCI-H1650)細(xì)胞中,通過嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)克隆,以未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空病毒組作對照,RT-PCR及Western b1ot檢測Testin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞克隆形成實驗、MTT試劑盒檢測細(xì)胞增殖、Transwell法檢測細(xì)胞侵襲。分析Testin對于肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的影響。結(jié)果:利用RT-PCR結(jié)果提示,發(fā)現(xiàn)Testin在肺癌細(xì)胞株LTEP-a-2,NCI-H1650,A549中的表達(dá)水平均低于16HBE,差異有顯著性(P0.01)。對比癌旁正常組織,70%(21/30)的肺癌組織中Testin mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào),有顯著差異(P=0.000)。Western blotting檢測結(jié)果提示66%(20/30)的肺癌組織中Testin蛋白表達(dá)降低(P=0.000)。免疫組化結(jié)果提示與癌旁正常組織對比,Testin在肺癌組織中表達(dá)顯著下降(P0.05)。Testin基因表達(dá)在患者的年齡、性別、腫瘤大小、吸煙、病理類型等分組中均無相關(guān)性(P0.05)。Testin基因表達(dá)與肺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān),(r=0.546,r=0.602,r=0.520,P0.05)。分期越晚、分化程度越低、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移,Testin表達(dá)量越少。高分化、中分化、低分化三者之間有顯著性差異(P0.05)。構(gòu)建Testin過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體,分別在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H1650中轉(zhuǎn)染Testin基因過表達(dá)慢病毒載體,經(jīng)RT-PCR及Western blotting檢測證實轉(zhuǎn)染成功并篩選出穩(wěn)定過表達(dá)Testin基因的肺癌細(xì)胞系,且過表達(dá)細(xì)胞株生長狀態(tài)表現(xiàn)好。MTT結(jié)果顯示在Testin表達(dá)量較少的A549及NCI-H1650肺癌細(xì)胞株中過表達(dá)Testin可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的增殖能力減弱(P0.05)。細(xì)胞克隆形成試驗顯示過表達(dá)Testin基因可導(dǎo)致細(xì)胞克隆形成能力減弱(P0.05)。Transwell試驗結(jié)果顯示過表達(dá)Testin基因可降低肺癌細(xì)胞侵襲性(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡試驗顯示過表達(dá)Testin基因可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P0.01)。結(jié)論:Testin在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)量顯著下降,而且與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期存在相關(guān)性。在體外實驗中利用成功轉(zhuǎn)染了Testin過表達(dá)載體的肺癌細(xì)胞證明了Testin基因可以作為抑癌基因可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、克隆形成等腫瘤惡性生物學(xué)行為,并促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：2460378