【摘要】：目的：揭示腫瘤微環(huán)境啟動前列腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT并形成DTCs的分子機(jī)制,對該過程進(jìn)行阻斷,以減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。方法：運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系(PC3-luc, C4-2B-luc, RM-1-luc),并以皮下接種的方式建立小鼠前列腺癌模型,待腫瘤長到一定大小時,將皮下腫瘤取出再培養(yǎng)并運(yùn)用Western blot檢測EMT標(biāo)記蛋白的變化；運(yùn)用RT-PCR檢測皮下接種前列腺癌小鼠的DTC細(xì)胞；對親本前列腺癌細(xì)胞及小鼠皮下前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特點(diǎn)的比較,并探索其分子機(jī)制；此外本研究還建立了前列腺癌細(xì)胞心內(nèi)注射和脛骨注射轉(zhuǎn)移模型,并分離培養(yǎng)了特異性肺轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞。結(jié)果：本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系,建立了小鼠皮下前列腺癌接種模型,檢測到了小鼠骨髓中存在DTC細(xì)胞,且皮下腫瘤再培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生了EMT改變,并獲得了更強(qiáng)的增殖、遷移侵襲及血管再生能力。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)其可能是由于Akt調(diào)控MCP-1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn),或經(jīng)Akt/AMPK α/mTOR信號通路調(diào)控所致。此外本研究建立的心內(nèi)注射小鼠模型和脛骨注射小鼠模型均發(fā)生了全身多臟器的轉(zhuǎn)移。結(jié)論：接種于小鼠皮下的前列腺癌細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境的作用下,發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化并促進(jìn)了DTCs的產(chǎn)生,且其獲得了更強(qiáng)的增殖、遷移侵襲和血管形成能力。這可能是由于Akt調(diào)控MCP-1高表達(dá)或Akt/AMPK α /mTOR信號通路調(diào)控所致。心內(nèi)注射及脛骨注射腫瘤模型可用于器官特異性轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究。第一部分建立穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系目的：構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系。方法：對pCDNA3.1、 pGL3-control、pGL4.50及包裝質(zhì)粒VSV-G、pRRE、 RSV-REV進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及擴(kuò)增提�。粚CDNA3.1, pGL3-control脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染,pGL4.50脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,pGL4.50電穿孔轉(zhuǎn)染法,pGLV4-EF1a-Luc慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase前列腺癌細(xì)胞株進(jìn)行比較。根據(jù)GFP的表達(dá)量,運(yùn)用流式細(xì)胞分選術(shù)收集高表達(dá)GFP的pGLV4-EF1a-Luc慢病毒轉(zhuǎn)染的PC3-luc和C4-2B-luc細(xì)胞；構(gòu)建luciferase慢病毒載體,運(yùn)用菌液PCR,質(zhì)粒電泳純化雙酶切及質(zhì)粒測序等方法鑒定連接正確的慢病毒載體,運(yùn)用VSV-G、pRRE、RSV-REV三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝并轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞株,Blasticidin抗生素進(jìn)行陽性篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞株以及其他種類的細(xì)胞株。結(jié)果：在對多種轉(zhuǎn)染方法比較之后,本研究最終選用購白上海吉瑪公司的pGLV4-EF la-Luc慢病毒液構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)luciferase勺PC3和C4-2B兩株前列腺癌細(xì)胞系PC3-luc和C4-2B-luc,并運(yùn)用流式細(xì)胞儀分選出了GFP強(qiáng)陽性的細(xì)胞。另外本研究自行構(gòu)建了luciferase慢病毒載體,挑選出菌液PCR、雙酶切、測序等方法驗(yàn)證正確的載體進(jìn)行擴(kuò)增和包裝,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)luciferase的小鼠RM-1前列腺癌細(xì)胞株RM-1-luc以及其他種類的前列腺癌細(xì)胞株,肝癌,乳腺癌,肺癌,卵巢癌及部分耐藥株等在內(nèi)的熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞,以供實(shí)驗(yàn)室其他研究所用。結(jié)論：與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法及電穿孔轉(zhuǎn)染法相比,慢病毒轉(zhuǎn)染法更適于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。第二部分建立前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)發(fā)生EMT的研究模型目的：建立PC3-luc, C4-2B-luc, RM-1-luc小鼠皮下接種腫瘤模型,發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件。方法：將PC3-luc細(xì)胞接種于裸鼠皮下,C4-2B-luc細(xì)胞接種于SCID小鼠皮下和RM-1-luc細(xì)胞接種于C57BL/6J小鼠皮下(2×106cells/只)；接種后每周一次活體成像,每周2次游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積并監(jiān)測小鼠體重變化,實(shí)時動態(tài)觀察腫瘤生長；待腫瘤長到一定大小時,將小鼠處死,取皮下腫瘤進(jìn)行體外再培養(yǎng)(PC3-lucs1, C4-2B-lucs1, RM-l-luc s1),觀察皮下腫瘤細(xì)胞的形態(tài)改變并運(yùn)用WB檢測與親本細(xì)胞相比,皮下腫瘤再培養(yǎng)細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白的改變。結(jié)果：成功構(gòu)建了PC3-luc, C4-2B-luc, RM-1-luc皮下接種腫瘤模型并獲得了皮下腫瘤生長曲線；皮下腫瘤再培養(yǎng)細(xì)胞與親本細(xì)胞相比,形態(tài)發(fā)生了改變。EMT標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)在與親本細(xì)胞相比,Vimentin和snail在PC3-luc s1細(xì)胞中的表達(dá)增高,而E-cadherin, claudin-1和ZO-1在PC3-lucs1細(xì)胞中的表達(dá)下降。結(jié)論：皮下腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT改變。第三部分骨髓播散腫瘤細(xì)胞的檢測目的：檢測皮下接種腫瘤細(xì)胞小鼠模型骨髓中是否存在DTC細(xì)胞方法：接種了腫瘤細(xì)胞的小鼠待皮下腫瘤長到一定大小時,將小鼠處死,分離髂骨、股骨和脛骨(髂骨和股骨用于分離骨髓,脛骨用于固定脫鈣包埋),髂骨和股骨沖出骨髓后分別提取總RNA用于PCR檢測。PC3-TxR, DU145, CNE2小鼠骨髓來自于本實(shí)驗(yàn)室其他課題組的皮下腫瘤細(xì)胞接種模型�？俁NA逆轉(zhuǎn)錄后檢測Luc2和Human GAPDH基因在小鼠骨髓mRNA水平的表達(dá)情況,小鼠GAPDH作為內(nèi)參；脛骨置于10%中性福爾馬林中固定24小時后,轉(zhuǎn)入10%EDTA脫鈣完全后轉(zhuǎn)移至70%乙醇保存并進(jìn)行石蠟包埋和切片。結(jié)果：PCR結(jié)果顯示在這些腫瘤細(xì)胞接種的小鼠骨髓中有Luc2和Human GAPDH的表達(dá),而他們在正常對照小鼠的骨髓中沒有表達(dá)。結(jié)論：皮下接種了腫瘤細(xì)胞的小鼠骨髓中出現(xiàn)了DTCs第四部分腫瘤微環(huán)境促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的改變目的：檢測EMT發(fā)生后,獲得了間充質(zhì)表型的PC3-luc s1細(xì)胞的生物學(xué)特性改變。方法：將PC3, PC3-luc和PC3-luc s1細(xì)胞分別再次注射于裸鼠皮下2×106cells/只),每周進(jìn)行一次活體成像,每周兩次游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小及體重監(jiān)測,比較兩株細(xì)胞在腫瘤生長過程中所發(fā)生的變化。待腫瘤生長到一定大小時,將小鼠處死,分離皮下腫瘤,比較組織改變；用MTS法體外比較PC3, PC3-luc和PC3-luc s1的細(xì)胞增殖情況；運(yùn)用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室比較PC3, PC3-luc和PC3-luc s1三株細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果：在體內(nèi),PC3-luc s1小鼠皮下腫瘤比PC3和PC3-luc小鼠皮下腫瘤生長速度快,均勻且表面布有更豐富的血管；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)與PC3及PC3-luc細(xì)胞相比,PC3-luc s1細(xì)胞增殖速度并未增加,遷移和侵襲能力均有增強(qiáng)。結(jié)論：與PC3和PC3-luc相比,發(fā)生了EMT改變后的PC3-luc s1具有了更強(qiáng)的增殖,遷移侵襲和血管生成能力。第五部分 微環(huán)境誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT并形成DTCs的作用機(jī)制目的：揭示前列腺癌細(xì)胞在體內(nèi)生長過程中發(fā)生EMT并產(chǎn)生DTCs的分子機(jī)制。方法：運(yùn)用antibody array, Protein/DNA array檢測PC3, PC3-luc, PC3-luc s1, C4-2B, C4-2B-luc, C4-2B-Iuc s1細(xì)胞的差異條件培養(yǎng)上清蛋白表達(dá)和核蛋白差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子;運(yùn)用STRING 10.0軟件分析其可能的相關(guān)通路；通過ELISA和熒光定量RT-PCR驗(yàn)證其差異表達(dá)蛋白在PC3, PC3-luc, PC3-luc s1中的表達(dá),Western blot驗(yàn)證核差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子,并檢測相關(guān)重要通路蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：與親本細(xì)胞相比,MCP-1在PC3-lucs1和C4-2B-lucs1條件培養(yǎng)上清中的表達(dá)均有增高;在PC3-lucs1細(xì)胞核中,轉(zhuǎn)錄因子c-Myb, SP-1表達(dá)下調(diào),c-Jun表達(dá)上調(diào),而CREB變化不大。總蛋白Western blot檢測結(jié)果顯示：p-Akt, Akt, p-AMPK α, AMPK α, p-mTOR, mTOR, p-p70S6K, p70S6K, p-4E-BP1,4E-BP1蛋白在PC3, PC3-luc, PC3-lucs1中的表達(dá)有變化,其中p-mTOR表達(dá)下調(diào),p-p70S6K, p-4E-BP1和p-GSK-3β表達(dá)上調(diào),總蛋白均不變。結(jié)論；EMT的發(fā)生,及腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成有可能是通過Akt經(jīng)AP-1調(diào)控MCP-1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn),或經(jīng)Akt/AMPK α/mTOR信號通路調(diào)控所致。第六部分小鼠器官特異性轉(zhuǎn)移模型的建立目的：建立PC3-luc及RM-1-luc小鼠心內(nèi)注射和脛骨注射轉(zhuǎn)移模型方法：將2×105個PC3-luc和RM-1-luc細(xì)胞以心內(nèi)注射的方式和脛骨注射的方式分別注射于SCID小鼠和C57BL/6J小鼠,每周一次活體成像觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況,每周稱重兩次監(jiān)測小鼠身體狀況。待轉(zhuǎn)移瘤長到一定大小時,將小鼠處死,取出內(nèi)臟做活成像離體曝光,留取部分肺部轉(zhuǎn)移小鼠做轉(zhuǎn)移瘤體外再培養(yǎng)。結(jié)果：PC3-luc細(xì)胞建立的心內(nèi)注射模型小鼠約在4周后開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,包括肺部轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移；PC3-luc細(xì)胞建立的脛骨注射模型小鼠在原位生長充滿整個腿部及腳部的骨髓腔,并在8周后開始轉(zhuǎn)移到對側(cè)腿部和腳部；RM-1-luc細(xì)胞心內(nèi)注射的模型小鼠約在1周后就出現(xiàn)了全身臟器的轉(zhuǎn)移,包括腦、心臟、肺臟、肝臟、腎臟等,RM-1-luc細(xì)胞脛骨注射的模型小鼠不僅在骨髓腔內(nèi)生長,且約在1周后出現(xiàn)以肺部轉(zhuǎn)移為主的腦轉(zhuǎn)移、心臟轉(zhuǎn)移和肝臟轉(zhuǎn)移等；PC3-luc和RM-1-luc細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株被收集體外再培養(yǎng)。結(jié)論：心內(nèi)注射前列腺癌小鼠模型可發(fā)生全身主要臟器的轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移,而脛骨注射前列腺癌小鼠模型,腫瘤不僅在注射部分的骨髓腔內(nèi)生長,并可發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-37
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本文編號：2460268