【摘要】：前言食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)作為我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,具有病死率高、治療效果差的特點(diǎn)。目前ESCC的發(fā)病率僅次于肺癌、胃癌和肝癌。ESCC病因復(fù)雜,主要涉及吸煙、飲酒、流經(jīng)食物過(guò)熱、食管反流與遺傳等因素。因此,ESCC的生物學(xué)標(biāo)記物篩選和信號(hào)通路的闡明對(duì)ESCC診療具有重大意義。眾所周知,細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)需要細(xì)胞因子刺激,進(jìn)而通過(guò)胞膜或胞內(nèi)受體傳導(dǎo)到核內(nèi),調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá),參與細(xì)胞的各種生理病理活動(dòng)。在ESCC的過(guò)程中,細(xì)胞增殖起著重要的作用,ESCC發(fā)生發(fā)展時(shí)期,細(xì)胞增殖旺盛,伴隨著各種增殖相關(guān)通路的紊亂。體內(nèi)多種信號(hào)分子已被證實(shí)參與腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程。因此,對(duì)于細(xì)胞信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的研究成為ESCC分子機(jī)制以及治療的研究熱點(diǎn)。微小RNA (microRNA, miRNAs)是一類長(zhǎng)度在21～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,由基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控,并在轉(zhuǎn)錄后水平控制基因表達(dá),進(jìn)而參與炎癥、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖與凋亡等。隨著cDNA文庫(kù)、分子克隆技術(shù)、RNA組學(xué)及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的不斷發(fā)展,miRNA在基因調(diào)控中的地位越來(lái)越突出,很多熱點(diǎn)miRNA已經(jīng)在臨床疾病診斷、治療和預(yù)后的分析中得到應(yīng)用。目前的研究報(bào)道均表明,miRNAs與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián),其中,miR-146a是眾多科學(xué)家研究的重點(diǎn)。最新的成果表明,TOLL樣受體TLR2/4/5的配體以及TNF-α、IL-1等炎癥因子都是通過(guò)NF-κB依賴的途徑上調(diào)miR-146a的表達(dá),上調(diào)后的miR-146a進(jìn)而抑制TRAF6等蛋白上調(diào),進(jìn)一步影響NF-κB的蛋白活性,從而減少NF-κB通路下游TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子生成,阻止過(guò)度免疫反應(yīng)。另外,胰島素受體底物(insulin receptor substrate, IRS)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的胰島素信號(hào)通路中一個(gè)重要蛋白。迄今為止,研究證實(shí)IRS具有四個(gè)亞型,其中,IRS1和IRS2尤為關(guān)注。IRS1廣泛分布于胰島素作用的所有外周組織,如骨骼肌、脂肪和肝臟,其主要在骨骼肌中表達(dá)。目前,人類和鼠IRS1的氨基酸序列已經(jīng)證實(shí)具有高度種屬性和組織保守性。IRS1的N末端有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,包括PH(pleckstrin homology)和PTB(phosphotyrosine binding)。PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)磷脂與含有酸性結(jié)構(gòu)的蛋白相互作用。PTB結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別磷酸化NPXY的酪氨酸殘基,使IRS1能夠和IGF-1R和胰島素受體IR近膜區(qū)的Tyr950或Tyr960發(fā)生耦聯(lián)�？傊�,IRS1在機(jī)體的外周組織代謝、細(xì)胞增殖和分化中起著重要的作用。近年來(lái),IRS2在腫瘤生長(zhǎng)、增殖與遷移中的作用也越來(lái)越重視。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-146a在食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況,結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析,探討miR-146a與食管鱗癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。同時(shí),本組檢測(cè)miR-146a和IRS2在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)變化,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)觀察miR-146a對(duì)IRS2基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)過(guò)程的影響,進(jìn)而明確]miR-146a/IRS2靶基因網(wǎng)絡(luò)在食管鱗癌診療中的意義。方法與結(jié)果：1、Real-time PCR檢測(cè)miR-146a在食管鱗癌組織中的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系本組通過(guò)Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了miR-146a在60例食管鱗癌組織中的表達(dá)情況。在60例食管鱗癌周圍正常組織中,miR-146a的表達(dá)量為10.10-±2.30；然而miR-146a在食管鱗癌組織中的表達(dá)量為3.464-1.22,較正常食管組織有顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)分析miR-146a與多項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系發(fā)現(xiàn),miR-146a與食管鱗癌的分化程度(p=0.021)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.004)以及臨床分期(p=0.039)顯著相關(guān),而與其它年齡、性別等臨床指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。結(jié)果提示,miR-146a在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平較正常組織顯著下降；同時(shí),miR-146a可能參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的過(guò)程。2、miR-146a在人食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)本組提取ESCC細(xì)胞的總RNA,用特異的：miR-146a反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)成cDNA, Real-time PCR檢測(cè)miR-146a在三種不同分化程度的ESCC細(xì)胞株中的表達(dá)情況并使用食管正常上皮HEEC細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照。以2-,xzxCT法來(lái)計(jì)算miR-146a的表達(dá)量,以U6作為內(nèi)參。本組發(fā)現(xiàn),miR-146a在HEEC中高表達(dá),表達(dá)量明顯高于三種ESCC細(xì)胞株。在高分化的EC109細(xì)胞中,miR-146a的表達(dá)量顯著下降,與HEEC相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。在中分化的TE8細(xì)胞中,miR-146a的表達(dá)量進(jìn)一步下調(diào)。在低分化TE2細(xì)胞中,miR-146a的表達(dá)量達(dá)到了最低。3、IRS2在人食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)并受miR-146a的調(diào)節(jié)本組利用Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)IRS2在正常HEEC細(xì)胞及3株食管鱗癌細(xì)胞EC109、TE8和TE2中mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),食管鱗癌細(xì)胞系中,IRS2的]mRNA水平和蛋白表達(dá)水平隨分化程度逐漸增強(qiáng)。通過(guò)Microinspector、 miRanda及targetscan三個(gè)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-146a對(duì)IRS2具有生物信息學(xué)上的調(diào)控作用,那么miR-146a可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控IRS2表達(dá)。本組進(jìn)而設(shè)計(jì)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-146a對(duì)IRS2 3'URT的影響。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-146a的mimics或者NCmiRNA來(lái)調(diào)節(jié)miR-146a的表達(dá)水平,然后檢測(cè)IRS2的蛋白表達(dá)水平；對(duì)比發(fā)現(xiàn),miR-146a能夠顯著下調(diào)IRS2蛋白水平。結(jié)果提示miR-146a能夠通過(guò)與IRS2 3'URT區(qū)結(jié)合,抑制IRS2翻譯而下調(diào)其表達(dá)。4、miR-146a抑制食管鱗癌增殖、遷移以及侵襲選取ESCC的細(xì)胞株EC109與TE8,通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-146a的mimics來(lái)調(diào)節(jié)miR-146a的表達(dá)水平；CCK-8與小室遷移侵襲試驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。相比于對(duì)照組,上調(diào)]miR-146a的表達(dá)后EC109與TE8細(xì)胞的增殖、遷移能力、侵襲能力顯著下降,而對(duì)照組的增殖、遷移與侵襲能力沒(méi)有發(fā)生顯著的變化。結(jié)果證實(shí),下調(diào)miR-146a能顯著促進(jìn)食管鱗癌轉(zhuǎn)移及侵襲進(jìn)程。5、過(guò)表達(dá)IRS2能夠逆轉(zhuǎn)miR-146a抑制的ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為本組通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在共轉(zhuǎn)染pc-IRS2組的EC109細(xì)胞中,上調(diào)IRS2表達(dá)后的細(xì)胞組的遷移能力顯著增加；而在共轉(zhuǎn)染pc-DNA對(duì)照組的EC109細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力顯著下降,二者具有顯著差異。結(jié)果提示,過(guò)表達(dá)IRS2后能顯著解除miR-146a抑制的遷移能力。本組通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在共轉(zhuǎn)染pc-IRS2的EC109細(xì)胞中,IRS2的表達(dá)水平上調(diào)且能顯著增加穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目,而在共轉(zhuǎn)染pc-DNA對(duì)照組中,穿過(guò)基質(zhì)膠的EC109細(xì)胞數(shù)目明顯下降,二者具有顯著差異。結(jié)果提示,過(guò)表達(dá)IRS2后能顯著解除miR-146a抑制的侵襲能力。結(jié)論：本組首次檢測(cè)miR-146a在食管鱗癌中的表達(dá)水平,證實(shí)miR-146a在食管鱗癌細(xì)胞系、原發(fā)癌組織及淋巴轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)水平均顯著下降,且miR-146a的表達(dá)下調(diào)與食管鱗癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),提示niR-146a在食管鱗癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。以三種不同分化程度的食管鱗癌細(xì)胞為模型,本組闡明miR-146a通過(guò)抑制IRS2基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯而下調(diào)IRS2的表達(dá),明確miR-146a-IRS2系統(tǒng)在腫瘤分化、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制,揭示了miR-146a-IRS2的全新調(diào)控方式。同時(shí),本研究更將為ESCC臨床診斷提供了可行的標(biāo)志物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1

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