【摘要】：侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要特征,也是惡性腫瘤致死的主要原因[1]。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)控的分子機(jī)制研究一直是腫瘤生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)CD147和Annexin A2都參與了腫瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排,是調(diào)控腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的重要分子。我們前期的工作發(fā)現(xiàn)CD147通過調(diào)控Annexin A2活化的Rho A信號(hào)通路參與了肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)控,在此基礎(chǔ)上本課題進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。本課題主要包括三個(gè)部分:第一部分,CD147與Annexin A2相互作用的研究。我們應(yīng)用免疫共沉淀和質(zhì)譜聯(lián)用的方法,發(fā)現(xiàn)Annexin A2是CD147可能的互作分子�；诩す夤簿劢沟墓捕ㄎ环治鲲@示CD147和Annexin A2在肝癌和肺癌細(xì)胞中有很好的共定位。接著我們采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(FRET)證實(shí)CD147和Annexin A2在活細(xì)胞中存在直接的相互作用。我們表達(dá)并純化了CD147胞外段蛋白和Annexin A2蛋白,采用表面等離子共振技術(shù)(SPR)測(cè)定了CD147和Annexin A2相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。然后,將CD147截短表達(dá),采用His Pull-Down、FRET、SPR等方法明確了CD147胞外段能與Annexin A2相互作用。第二部分,CD147調(diào)控Annexin A2磷酸化的分子機(jī)制研究。我們首先檢測(cè)了Src、CD147對(duì)Annexin A2酪氨酸磷酸化的影響,我們發(fā)現(xiàn)Src激酶能磷酸化Annexin A2,而CD147能負(fù)向調(diào)控Annexin A2的酪氨酸磷酸化,這與之前的報(bào)道一致。同時(shí)過表達(dá)Src和CD147,我們發(fā)現(xiàn)CD147能抑制Src對(duì)Annexin A2的磷酸化。體外激酶實(shí)驗(yàn)證實(shí),CD147胞外段蛋白和I結(jié)構(gòu)域蛋白能夠抑制Src對(duì)Annexin A2的磷酸化,而C2結(jié)構(gòu)域蛋白則不能抑制Src對(duì)Annexin A2的磷酸化。據(jù)此,采用FRET實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步分析了C2結(jié)構(gòu)域和I結(jié)構(gòu)域與Annexin A2 N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況,我們發(fā)現(xiàn)只有I結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合Annexin A2的N端結(jié)構(gòu)域,這就提示CD147通過其I結(jié)構(gòu)域與Annexin A2的N端結(jié)構(gòu)域相互作用從而抑制了Src對(duì)Annexin A2的磷酸化。第三部分,p-Annexin A2調(diào)控腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制研究。我們檢測(cè)了CD147和Annexin A2對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響,我們發(fā)現(xiàn)CD147能夠通過調(diào)控Annexin A2的酪氨酸磷酸化進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng),然而其具體機(jī)制仍不明確。通過下調(diào)Annexin A2表達(dá)后檢測(cè)DOCK家族GEF的mRNA表達(dá)水平,我們發(fā)現(xiàn)DOCK3表達(dá)水平顯著降低。通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性Annexin A2后回復(fù)表達(dá)野生型Annexin A2、Annexin A2的磷酸化位點(diǎn)突變體,我們發(fā)現(xiàn)DOCK3表達(dá)水平受Annexin A2磷酸化水平的調(diào)控。這提示p-Annexin A2可能通過DOCK3調(diào)控腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。通過檢測(cè)Rac1、Rho A的活性及下游效應(yīng)分子的表達(dá)水平,我們發(fā)現(xiàn)DOCK3是Rac1的GEF,而WAVE2的表達(dá)水平與DOCK3呈負(fù)相關(guān),且下調(diào)DOCK3后細(xì)胞的片狀偽足形成顯著增多。進(jìn)一步研究證實(shí)DOCK3能夠通過負(fù)向調(diào)控β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制WAVE2的表達(dá)。應(yīng)用CD147敲除的肝癌、結(jié)腸癌細(xì)胞系以及CD147穩(wěn)定干涉的肺癌細(xì)胞系,我們證實(shí)了CD147通過p-Annexin A2/DOCK3/β-catenin/WAVE2信號(hào)軸調(diào)控片狀偽足形成和腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。最后我們建立了裸鼠脾臟注射轉(zhuǎn)移模型,結(jié)果表明CD147能夠促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移,這提示CD147促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)可能是其調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：2454990