【摘要】：背景:頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是一種發(fā)生于口腔、鼻腔、鼻竇、咽部和喉部等黏膜組織的腫瘤,在人體惡性腫瘤中占第六位,擁有較高的致死率和致殘率。盡管臨床綜合治療方法提高了部分病人的療效,但進(jìn)展期(T3和T4)HNSCC患者的五年生存率未見(jiàn)顯著提高。因此,亟待新的治療理念和新型化療藥物尤其是分子靶向藥物來(lái)治療HNSCC患者并提高其的生存期。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STATs)家族是一類在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要甚至關(guān)鍵作用的蛋白。STAT3是STATs家族中與腫瘤關(guān)系最為密切的成員,是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,也是一種癌基因編碼的細(xì)胞質(zhì)蛋白,可以被許多肽類蛋白如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子激活。這些激活物直接或間接(通過(guò)激活細(xì)胞膜表面受體)磷酸化激活STAT3分子,磷酸化的STAT3單體通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域互相作用,形成同源或異源二聚體。其結(jié)果是,二聚體STAT3進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的DNA相結(jié)合,調(diào)控與細(xì)胞增殖、周期、凋亡和血管生成等下游相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。在正常生理?xiàng)l件下,被激活的STAT3會(huì)在短時(shí)間內(nèi)脫磷酸滅活變成單體回到細(xì)胞質(zhì)中。而在人體主要的惡性腫瘤細(xì)胞中,STAT3的激活具有持續(xù)高表達(dá)的特點(diǎn),持續(xù)激活的STAT3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、刺激腫瘤組織內(nèi)部血管的生長(zhǎng)等,這些變化都會(huì)加重腫瘤患者的病情。相反,靶向阻斷STAT3激活則能夠逆轉(zhuǎn)STAT3的作用,進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此,針對(duì)STAT3磷酸化激活,已開(kāi)發(fā)出多種不同作用機(jī)制的抑制劑并進(jìn)行了體外和體內(nèi)研究。遺憾的是,由于不明確的副作用和藥物本身特點(diǎn)等,沒(méi)有一種抑制劑用于臨床治療腫瘤和臨床實(shí)驗(yàn)研究。雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是一種從中草藥—青蒿素中提取的倍半萜內(nèi)酯類物質(zhì)衍生物,也是青蒿素治療瘧疾的主要活性成分。DHA抗瘧作用優(yōu)良,是用于治療耐藥瘧疾、惡性瘧疾和腦型瘧疾的最有效藥物之一。近年的大量研究顯示,DHA能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),其機(jī)制主要是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期和抗血管生成而實(shí)現(xiàn)的。盡管一些研究對(duì)dha的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了探討,但對(duì)hnscc細(xì)胞是否有抑制作用,以及其對(duì)凋亡和細(xì)胞周期上游信號(hào)通路的影響至今不清楚。目的:1.評(píng)估dha對(duì)hnscc細(xì)胞的增殖、周期、凋亡及遷移的影響;2.探討dha成為一種stat3抑制劑的可能性;3.觀察dha與順鉑聯(lián)用對(duì)hnscc細(xì)胞的殺傷作用;4.建立hnscc移植瘤動(dòng)物模型,評(píng)估dha對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的作用。方法:本課題分三部分進(jìn)行研究。第一部分dha對(duì)hnscc增殖、周期和遷移影響的研究。首先,用mtt方法觀察dha干預(yù)fadu、cal-27和hep-2細(xì)胞24和48h后細(xì)胞活力情況,計(jì)算出相應(yīng)ic50后設(shè)定合理藥物干預(yù)劑量。然后,不同濃度dha干預(yù)腫瘤細(xì)胞后,采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡和周期的變化情況,同時(shí)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力的變化。最后,用westernblot觀察dha對(duì)hnscc細(xì)胞抗凋亡、細(xì)胞周期和血管生成等相關(guān)重要蛋白表達(dá)的影響。第二部分dha抑制hnscc生長(zhǎng)的機(jī)制研究。首先,用westernblot觀察不同濃度dha對(duì)三種頭頸腫瘤細(xì)胞p-stat3、p-jak2、p-src、p-egfr、p-erk1/2和p-akt蛋白的影響。接著,用dha干預(yù)并用il-6(20ng/ml)刺激實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞后,觀察實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)p-jak2和p-stat3蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建dn-jak2、dn-egfr、dn-src和ca-stat3質(zhì)粒并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鱗癌cal-27細(xì)胞,用dha干預(yù)24h,westernblot觀察p-stat3、p-jak2、p-src和p-egfr蛋白變化情況,同時(shí)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)dha對(duì)轉(zhuǎn)染ca-stat3質(zhì)粒細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響,進(jìn)一步分析dha抑制hnscc增殖的機(jī)制。為進(jìn)一步探討dha對(duì)p-jak2和p-stat3的抑制作用,將其與stat3信號(hào)通路特異抑制劑azd1480及ag490一起處理實(shí)驗(yàn)hnscc細(xì)胞,對(duì)照比較分析dha成為一種新型stat3抑制劑的可能性。最后,將dha聯(lián)合順鉑干預(yù)hnscc細(xì)胞,探討其能否作為化療藥物用于治療腫瘤。第三部分dha抑制hnscc移植瘤生長(zhǎng)及其機(jī)制研究。利用頭頸鱗癌cal-27細(xì)胞建立移植瘤balb/c裸鼠動(dòng)物模型,給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50mg/kgdha或dmso進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)全程中觀察動(dòng)物體重和一般精神狀態(tài),定期測(cè)量移植瘤體積。28天后處死動(dòng)物,切除瘤組織后稱重并用westernblot觀察stat3信號(hào)通路上下游蛋白表達(dá)情況,免疫組化方法觀察p-stat3和p-jak2蛋白變化。驗(yàn)證dha的體外抗瘤結(jié)果的同時(shí),為進(jìn)一步用于hnscc患者的治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果:第一部分:dha抑制hnscc細(xì)胞增殖、周期和遷移。1.dha抑制三種hnscc細(xì)胞的增殖,且與劑量及干預(yù)時(shí)間呈依賴關(guān)系,其中,cal-27和hep-2兩種細(xì)胞對(duì)dha較敏感,而fadu細(xì)胞的敏感性則稍差;dha對(duì)三種細(xì)胞的抑制作用主要由細(xì)胞凋亡增多和g0/g1期阻滯引起的;同時(shí),dha也能抑制三種hnscc細(xì)胞的遷移能力。2.dha抑制fadu、hep-2和cal-27細(xì)胞mcl-1、bcl-xl、cyclind1、vegf、mmp-2和mmp-9蛋白的表達(dá),且與藥物劑量或時(shí)間呈依賴關(guān)系。第二部分:dha抑制hnscc細(xì)胞增殖與阻斷jak2/stat3信號(hào)通路激活有關(guān)。1.在常氧和低氧條件下,dha干預(yù)fadu、hep-2和cal-27細(xì)胞后,p-stat3(tyr705)蛋白表達(dá)下降,但對(duì)p-stat3(ser727)無(wú)明顯影響。2.不同劑量dha處理三種hnscc細(xì)胞后,p-jak2蛋白表達(dá)減少,而p-erk1/2、p-akt、p-src和p-egfr蛋白變化較小;并且,dha也能抑制il-6誘導(dǎo)的p-jak2和p-stat3。3.用dn-jak2、dn-egfr、dn-src、ca-stat3和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cal-27腫瘤細(xì)胞并鑒定。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的四組細(xì)胞用dha干預(yù)后,p-jak2下調(diào),而p-src和p-egfr無(wú)明顯變化;轉(zhuǎn)染ca-stat3質(zhì)粒則可逆轉(zhuǎn)dha引起的g0/g1期阻滯和細(xì)胞凋亡,并減輕p-stat3被抑制的程度。4.dha和stat3抑制劑azd1480及ag490一樣,可下調(diào)hnscc細(xì)胞p-jak2和p-stat3表達(dá),并與劑量呈依賴關(guān)系。5.hep-2和cal-27細(xì)胞用dha10μm聯(lián)合順鉑10μm、dha20μm聯(lián)合順鉑5或10μm處理后,fadu細(xì)胞用dha10或20μm聯(lián)合順鉑5或10μm處理,chou-talalayci值小于1,效應(yīng)點(diǎn)均落于直線內(nèi),細(xì)胞增殖顯著受到抑制(p0.01)。第三部分:dha抑制hnscc移植瘤生長(zhǎng)。干預(yù)組動(dòng)物應(yīng)用dha(50mg/kg,腹腔注射,5次/周)干預(yù)28天后,移植瘤體積顯著小于對(duì)照組,而動(dòng)物體重?zé)o明顯變化;瘤體組織p-jak2、p-stat3、mcl-1、bcl-xl、cyclind1、vegf、mmp-2和mmp-9蛋白表達(dá)降低,而p-erk1/2、p-akt、p-src、和p-egfr則變化較小。結(jié)論:1.DHA抑制HNSCC細(xì)胞的增殖和遷移,增加凋亡細(xì)胞,促進(jìn)G0/G1期阻滯的細(xì)胞數(shù)目,同時(shí)減少M(fèi)cl-1、Bcl-x L、Cyclin D1、VEGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá);2.DHA選擇性抑制HNSCC細(xì)胞的STAT3分子Tyr705位點(diǎn)的磷酸化,這種抑制作用是通過(guò)特異下調(diào)p-Jak2蛋白實(shí)現(xiàn)的,提示DHA作用在STAT3激活前的過(guò)程;3.DHA抑制HNSCC細(xì)胞STAT3和Jak2的激活,對(duì)Akt和ERK磷酸化無(wú)明顯影響,提示其有可能是一種新型的、具有一定特異的Jak2/STAT3信號(hào)通路抑制劑;4.DHA與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同抑制HNSCC細(xì)胞的效應(yīng),其機(jī)制是通過(guò)增加G0/G1期阻滯細(xì)胞數(shù)目實(shí)現(xiàn)的,提示DHA能夠與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用抑制腫瘤細(xì)胞增殖;5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),DHA能顯著抑制HNSCC移植瘤體積,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重等一般狀態(tài)無(wú)影響,同時(shí)減少瘤體組織中Jak2/STAT3信號(hào)通路下游重要蛋白(抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-x L,促周期蛋白Cyclin D1,促血管生成蛋白VEGF,促遷移蛋白MMP-2和MMP-9)表達(dá),提示其有可以成為一種用于臨床治療HNSCC患者的新型化療藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.91

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本文編號(hào)：2443260