【摘要】：Hepatopoietin Cn(HPPCn)是我們實驗室的研究人員發(fā)現(xiàn)的一個能夠特異性促進肝細胞增殖的蛋白因子。HPPCn能促進肝細胞DNA合成和細胞分裂,以及70%肝臟切除小鼠的肝臟再生,并且對CCl4引起的大鼠肝纖維化具有保護作用。本研究探討HPPCn對乙醇引起的慢性肝損傷的保護作用以及HPPCn在肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)轉(zhuǎn)移中與micro RNA(mi RNA,mi R)的調(diào)控關系及其對HCC轉(zhuǎn)移的意義。一、HPPCn激活鞘氨醇激酶(Sph K)信號促進肝臟損傷修復作用和機制我國肝臟病發(fā)病率高,大量飲酒導致的肝纖維化和肝硬化患者數(shù)量也在逐年增多。長期酒精攝入還會引起肝細胞DNA某些區(qū)域發(fā)生表觀遺傳學改變,使正常肝細胞轉(zhuǎn)化,從而具有干細胞或前體細胞性質(zhì),誘發(fā)HCC。因此尋找酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)新的干預靶點和治療策略,具有極其重要的社會意義。本實驗室前期的研究表明,重組人HPPCn蛋白(rh HPPCn)對乙醇引起的小鼠肝急性損傷具有保護作用,這種保護作用的發(fā)揮是通過緩解乙醇造成的氧化應激,減少脂質(zhì)過氧化作用實現(xiàn)的。另外,最近的研究指出,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,Sph K)/1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)/S1P受體(S1P receptors,S1PRs)信號軸參與了肝臟損傷及纖維化。我們已有的研究結果顯示,HPPCn可以激活肝細胞中Sph K信號通路。Sph K有兩個異構體,即Sph K1和Sph K2,在短期乙醇飼喂造成的小鼠急性肝損傷模型中,給予攜帶Sph K1基因的重組腺病毒(Ad-Sph K1)的治療效果與rh HPPCn蛋白的效果近似,這提示Sph K1/S1P/S1PRs信號軸可能介導了HPPCn對肝細胞的保護作用。本研究的目的之一是,在前期研究的基礎上,利用肝臟特異性高表達HPPCn的轉(zhuǎn)基因小鼠(HPPCnliver+/+)于體內(nèi)考察HPPCn對乙醇引起的慢性肝損傷的保護作用,并對Sph K1/S1P/S1PRs介導HPPCn發(fā)揮保護作用的機制進行驗證和分析。我們采用雄性HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠建立長期乙醇飼喂模型,野生型(wild-type,WT)小鼠作為對照。小鼠被隨機分入乙醇飼喂組(Et OH-fed)和對照飼喂組(Con-fed)。我們首先分析了小鼠血清中谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)的釋放情況,觀察了肝組織病理切片,以檢測HPPCn對酒精引起的肝細胞的保護作用。然后我們檢測了小鼠肝組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,分析HPPCn對乙醇引起的肝細胞脂質(zhì)過氧化作用的影響。為考察小鼠肝臟纖維化程度,我們還分析了肝組織中的膠原沉積,并測定了肝臟中羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的含量,以及與纖維化相關的基因的表達。實驗結果顯示,HPPCn在轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中特異性高表達。與對照組相比,HPPCn高表達能防止乙醇引起細胞轉(zhuǎn)氨酶釋放,改善肝組織病理改變,并能夠防止乙醇引起的MDA含量的增加,說明HPPCn能夠減少乙醇引起的脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生,對乙醇造成的慢性肝損傷具有保護作用。而且,HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠長期飼喂乙醇后,纖維化程度較對照組低,表現(xiàn)為較低的膠原沉積水平和Hyp含量,以及較低的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和前膠原α1(I)【Colα1(I)】表達水平。我們還進一步分析了小鼠Sph K1/S1P/S1PRs通路的表達情況。乙醇飼喂提高了HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中Sph K的活性和S1P的表達水平,但是對WT小鼠Sph K活性的影響不大,也沒有明顯提高WT小鼠肝臟中S1P的表達。在乙醇攝入的早期和后期,只有Sph K1在HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的表達相對于Con-fed組及WT小鼠顯著升高,Sph K2的表達沒有明顯改變。這些結果提示,HPPCn高表達與Sph K活性提高以及S1P增加相關。另外,S1PRs的表達顯示,乙醇飼喂3日后,HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠中S1PR3 m RNA水平上升。在野生型小鼠中,乙醇飼喂8周后S1PR2 m RNA水平明顯下降,而在HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠中在觀察到相反的趨勢,S1PR2 m RNA水平顯著升高。我們認為這些結果提示,在急性和慢性肝損傷中HPPCn激活不同的S1PRs。除此以外,我們的研究還發(fā)現(xiàn),HPPCn能夠激活肝細胞中Sph K的激酶活性,進而增加Erk1/2的磷酸化,且這一作用具有S1PR3依賴性。二、HPPCn調(diào)控mi RNA 17-92影響肝癌發(fā)生發(fā)展的作用和機制本實驗室的研究發(fā)現(xiàn),在HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠DEN誘導肝癌模型中,HPPCn在肝臟中特異高表達在誘導早期能增加原癌基因c-myc的表達,并明顯增加肝癌細胞的肺轉(zhuǎn)移率。Mi RNA作為一種非編碼小分子單鏈RNA,在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。一些重要的mi RNA簇在肝癌細胞中也存在異常表達,它們通過調(diào)控P53,PTEN,c-myc等重要信號通路而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,已經(jīng)成為腫瘤治療的新型靶點。mi R-17-92基因簇是一個高度保守的基因簇,異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關,其參與調(diào)控肝癌細胞生物學特性的作用和機制還不清楚。我們推測HPPCn和c-myc以及mi R-17-92可能具有相關性。在此基礎上,本研究的第二個目的是闡明HPPCn/c-myc/mi R-17-92在肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移中的調(diào)控關系,系統(tǒng)分析HPPCn/c-myc/mi R-17-92信號在肝細胞癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用以及作為肝癌治療靶點的可能性。為此,我們首先檢測了HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織的mi RNA表達譜,結果顯示,HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織與非轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織比較,mi R-17-92在HPPCn轉(zhuǎn)基因鼠的肝癌組織中的表達顯著增加。我們檢測三者在HCC細胞系中的表達情況,并結合臨床肝癌病人的標本觀察來考察HPPCn、mi R17-92及c-myc的調(diào)控關系,并通過rh HPPCn及RNAi處理進行驗證。然后我們利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達mi R-17-92的肝癌細胞系,并利用裸鼠皮下荷瘤實驗和脾臟注射實驗考察mi R-17-92對HCC細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。此外,我們建立mi R-17-92基因敲除動物模型,考察其在肝癌誘發(fā)中的作用。我們的結果顯示,mi R-17-92的表達與HCC細胞的轉(zhuǎn)移能力以及HPPCn和c-myc表達正相關。我們采用RNAi干擾敲低肝癌細胞中HPPCn的水平,發(fā)現(xiàn)mi R-19a,mi R-20和mi R-92的表達下調(diào);而用rh HPPCn刺激肝癌細胞可以上調(diào)c-myc和mi R-17-92簇的表達;并且在敲低肝癌細胞中c-myc的表達后,HPPCn對mi R-17-92的上調(diào)作用消失。臨床標本觀察也顯示,mi R-17-92在肝癌組織中高表達,并且HPPCn與mi R-17,mi R-18,mi R-19a,mi R-92密切相關。除此之外我們發(fā)現(xiàn),慢病毒載體介導的mi R-17-92高表達對HCC增殖能力的影響不明確。然而,高表達mi R-17-92可以促進皮下移植瘤內(nèi)的血管形成,而且mi R-17-92高表達可以顯著提高HCC細胞的體外遷移能力和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力,在脾臟注射模型中,mi R-17-92高表達組出現(xiàn)較多的肝臟、肺臟以及腹腔轉(zhuǎn)移。在本研究中,我們用mi R-17-92基因敲除小鼠建立肝癌誘發(fā)模型,發(fā)現(xiàn)mi R-17-92的敲除可以降低原癌基因c-myc和肝癌標志物甲胎蛋白(AFP)的表達。本研究表明,HPPCn通過c-myc調(diào)控mi R-17-92及其下游靶基因,HPPCn/c-myc/mi R-17-92信號系統(tǒng)與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關,可能成為腫瘤治療的新靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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