【摘要】：Hepatopoietin Cn(HPPCn)是我們實(shí)驗(yàn)室的研究人員發(fā)現(xiàn)的一個(gè)能夠特異性促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的蛋白因子。HPPCn能促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞分裂,以及70%肝臟切除小鼠的肝臟再生,并且對(duì)CCl4引起的大鼠肝纖維化具有保護(hù)作用。本研究探討HPPCn對(duì)乙醇引起的慢性肝損傷的保護(hù)作用以及HPPCn在肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)轉(zhuǎn)移中與micro RNA(mi RNA,mi R)的調(diào)控關(guān)系及其對(duì)HCC轉(zhuǎn)移的意義。一、HPPCn激活鞘氨醇激酶(Sph K)信號(hào)促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)作用和機(jī)制我國(guó)肝臟病發(fā)病率高,大量飲酒導(dǎo)致的肝纖維化和肝硬化患者數(shù)量也在逐年增多。長(zhǎng)期酒精攝入還會(huì)引起肝細(xì)胞DNA某些區(qū)域發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變,使正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而具有干細(xì)胞或前體細(xì)胞性質(zhì),誘發(fā)HCC。因此尋找酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)新的干預(yù)靶點(diǎn)和治療策略,具有極其重要的社會(huì)意義。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明,重組人HPPCn蛋白(rh HPPCn)對(duì)乙醇引起的小鼠肝急性損傷具有保護(hù)作用,這種保護(hù)作用的發(fā)揮是通過緩解乙醇造成的氧化應(yīng)激,減少脂質(zhì)過氧化作用實(shí)現(xiàn)的。另外,最近的研究指出,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,Sph K)/1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)/S1P受體(S1P receptors,S1PRs)信號(hào)軸參與了肝臟損傷及纖維化。我們已有的研究結(jié)果顯示,HPPCn可以激活肝細(xì)胞中Sph K信號(hào)通路。Sph K有兩個(gè)異構(gòu)體,即Sph K1和Sph K2,在短期乙醇飼喂造成的小鼠急性肝損傷模型中,給予攜帶Sph K1基因的重組腺病毒(Ad-Sph K1)的治療效果與rh HPPCn蛋白的效果近似,這提示Sph K1/S1P/S1PRs信號(hào)軸可能介導(dǎo)了HPPCn對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究的目的之一是,在前期研究的基礎(chǔ)上,利用肝臟特異性高表達(dá)HPPCn的轉(zhuǎn)基因小鼠(HPPCnliver+/+)于體內(nèi)考察HPPCn對(duì)乙醇引起的慢性肝損傷的保護(hù)作用,并對(duì)Sph K1/S1P/S1PRs介導(dǎo)HPPCn發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證和分析。我們采用雄性HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠建立長(zhǎng)期乙醇飼喂模型,野生型(wild-type,WT)小鼠作為對(duì)照。小鼠被隨機(jī)分入乙醇飼喂組(Et OH-fed)和對(duì)照飼喂組(Con-fed)。我們首先分析了小鼠血清中谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)的釋放情況,觀察了肝組織病理切片,以檢測(cè)HPPCn對(duì)酒精引起的肝細(xì)胞的保護(hù)作用。然后我們檢測(cè)了小鼠肝組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,分析HPPCn對(duì)乙醇引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用的影響。為考察小鼠肝臟纖維化程度,我們還分析了肝組織中的膠原沉積,并測(cè)定了肝臟中羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的含量,以及與纖維化相關(guān)的基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HPPCn在轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中特異性高表達(dá)。與對(duì)照組相比,HPPCn高表達(dá)能防止乙醇引起細(xì)胞轉(zhuǎn)氨酶釋放,改善肝組織病理改變,并能夠防止乙醇引起的MDA含量的增加,說明HPPCn能夠減少乙醇引起的脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生,對(duì)乙醇造成的慢性肝損傷具有保護(hù)作用。而且,HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠長(zhǎng)期飼喂乙醇后,纖維化程度較對(duì)照組低,表現(xiàn)為較低的膠原沉積水平和Hyp含量,以及較低的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和前膠原α1(I)【Colα1(I)】表達(dá)水平。我們還進(jìn)一步分析了小鼠Sph K1/S1P/S1PRs通路的表達(dá)情況。乙醇飼喂提高了HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中Sph K的活性和S1P的表達(dá)水平,但是對(duì)WT小鼠Sph K活性的影響不大,也沒有明顯提高WT小鼠肝臟中S1P的表達(dá)。在乙醇攝入的早期和后期,只有Sph K1在HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的表達(dá)相對(duì)于Con-fed組及WT小鼠顯著升高,Sph K2的表達(dá)沒有明顯改變。這些結(jié)果提示,HPPCn高表達(dá)與Sph K活性提高以及S1P增加相關(guān)。另外,S1PRs的表達(dá)顯示,乙醇飼喂3日后,HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠中S1PR3 m RNA水平上升。在野生型小鼠中,乙醇飼喂8周后S1PR2 m RNA水平明顯下降,而在HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠中在觀察到相反的趨勢(shì),S1PR2 m RNA水平顯著升高。我們認(rèn)為這些結(jié)果提示,在急性和慢性肝損傷中HPPCn激活不同的S1PRs。除此以外,我們的研究還發(fā)現(xiàn),HPPCn能夠激活肝細(xì)胞中Sph K的激酶活性,進(jìn)而增加Erk1/2的磷酸化,且這一作用具有S1PR3依賴性。二、HPPCn調(diào)控mi RNA 17-92影響肝癌發(fā)生發(fā)展的作用和機(jī)制本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn),在HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌模型中,HPPCn在肝臟中特異高表達(dá)在誘導(dǎo)早期能增加原癌基因c-myc的表達(dá),并明顯增加肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移率。Mi RNA作為一種非編碼小分子單鏈RNA,在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。一些重要的mi RNA簇在肝癌細(xì)胞中也存在異常表達(dá),它們通過調(diào)控P53,PTEN,c-myc等重要信號(hào)通路而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,已經(jīng)成為腫瘤治療的新型靶點(diǎn)。mi R-17-92基因簇是一個(gè)高度保守的基因簇,異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān),其參與調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的作用和機(jī)制還不清楚。我們推測(cè)HPPCn和c-myc以及mi R-17-92可能具有相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上,本研究的第二個(gè)目的是闡明HPPCn/c-myc/mi R-17-92在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的調(diào)控關(guān)系,系統(tǒng)分析HPPCn/c-myc/mi R-17-92信號(hào)在肝細(xì)胞癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用以及作為肝癌治療靶點(diǎn)的可能性。為此,我們首先檢測(cè)了HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織的mi RNA表達(dá)譜,結(jié)果顯示,HPPCn轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織與非轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織比較,mi R-17-92在HPPCn轉(zhuǎn)基因鼠的肝癌組織中的表達(dá)顯著增加。我們檢測(cè)三者在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床肝癌病人的標(biāo)本觀察來考察HPPCn、mi R17-92及c-myc的調(diào)控關(guān)系,并通過rh HPPCn及RNAi處理進(jìn)行驗(yàn)證。然后我們利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達(dá)mi R-17-92的肝癌細(xì)胞系,并利用裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)和脾臟注射實(shí)驗(yàn)考察mi R-17-92對(duì)HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。此外,我們建立mi R-17-92基因敲除動(dòng)物模型,考察其在肝癌誘發(fā)中的作用。我們的結(jié)果顯示,mi R-17-92的表達(dá)與HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力以及HPPCn和c-myc表達(dá)正相關(guān)。我們采用RNAi干擾敲低肝癌細(xì)胞中HPPCn的水平,發(fā)現(xiàn)mi R-19a,mi R-20和mi R-92的表達(dá)下調(diào);而用rh HPPCn刺激肝癌細(xì)胞可以上調(diào)c-myc和mi R-17-92簇的表達(dá);并且在敲低肝癌細(xì)胞中c-myc的表達(dá)后,HPPCn對(duì)mi R-17-92的上調(diào)作用消失。臨床標(biāo)本觀察也顯示,mi R-17-92在肝癌組織中高表達(dá),并且HPPCn與mi R-17,mi R-18,mi R-19a,mi R-92密切相關(guān)。除此之外我們發(fā)現(xiàn),慢病毒載體介導(dǎo)的mi R-17-92高表達(dá)對(duì)HCC增殖能力的影響不明確。然而,高表達(dá)mi R-17-92可以促進(jìn)皮下移植瘤內(nèi)的血管形成,而且mi R-17-92高表達(dá)可以顯著提高HCC細(xì)胞的體外遷移能力和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力,在脾臟注射模型中,mi R-17-92高表達(dá)組出現(xiàn)較多的肝臟、肺臟以及腹腔轉(zhuǎn)移。在本研究中,我們用mi R-17-92基因敲除小鼠建立肝癌誘發(fā)模型,發(fā)現(xiàn)mi R-17-92的敲除可以降低原癌基因c-myc和肝癌標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)的表達(dá)。本研究表明,HPPCn通過c-myc調(diào)控mi R-17-92及其下游靶基因,HPPCn/c-myc/mi R-17-92信號(hào)系統(tǒng)與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2439857