【摘要】：引言急性髓細(xì)胞白血病是一種造血干、祖細(xì)胞增生失調(diào)造成的惡性血液系統(tǒng)疾病,具有病情進(jìn)展快,預(yù)后較差的特點。目前,造血干細(xì)胞移植是一種有效的治療方法,其中全身照射(TBI)聯(lián)合化療是經(jīng)典的移植前的預(yù)處理方案,可以最大程度上降低腫瘤負(fù)荷,提高療效。但是,盡管在移植前接受了放療和化療,仍有20%左右的患者在移植后不久復(fù)發(fā),在難治性白血病中的比例更高,這種現(xiàn)象提示難治性急性隨細(xì)胞白血病細(xì)胞存在抵抗放射線的作用,且尚未被學(xué)術(shù)界充分認(rèn)識。因此,研究急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞對放射線抗拒的機(jī)理,尋找新的治療靶點逆轉(zhuǎn)射線抵抗,進(jìn)而增加細(xì)胞放療敏感性,對提高治療療效具有重要意義。Hedgehog信號通路在胚胎發(fā)育進(jìn)程中具有重要作用,與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移具有密切相關(guān)性。更加值得注意的是,許多腫瘤臨床實驗研究結(jié)果顯示,Hedgehog信號通路的過表達(dá)與腫瘤治療療效不佳存在正相關(guān)；另外通過對胰腺癌、甲狀腺未分化癌、食管癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤的放射敏感性研究中也發(fā)現(xiàn),Hedgehog信號通路的過表達(dá)可以造成腫瘤對放射治療的抗拒,而通過下調(diào)該通路活性可以促進(jìn)這些腫瘤細(xì)胞的放射敏感性�，F(xiàn)已證實,Hedgehog信號通路可以調(diào)節(jié)許多下游基因,在生長因子信號傳導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞抗凋亡和組織細(xì)胞損傷修復(fù)中具有重要意義。因為這些相關(guān)基因參與的細(xì)胞活動很大程度上決定了細(xì)胞的放射敏感性,所以抑制Hedgehog通路逆轉(zhuǎn)放射抗拒被認(rèn)為是一種極具應(yīng)用價值的潛在治療手段。例如,在目前開展的一項基底細(xì)胞癌的臨床實驗中,使用抑制劑靶向阻滯Hedgehog序貫放射治療有望成為一種新的有效的治療策略。Hedgehog信號通路與其他信號通路之間的相互作用有助于探討阻滯Hedgehog信號通路帶來的放射增敏效應(yīng)。PI3K/AKT過表達(dá)是眾所周知的引起腫瘤細(xì)胞射線抵抗的主要原因,另一方面,NF-kB活化是放射線引起的DNA損傷修復(fù)過程中必不可少的因素。因此,下調(diào)PI3K/AKT和NF-kB活性是腫瘤細(xì)胞放射增敏研究中的熱點。盡管Hedgehog信號通路與PI3K/AKT/NF-kB通路之間的相互作用關(guān)系尚未完全闡明,但是許多研究已經(jīng)證明,Hedgehog信號通路是通過PI3K/AKT途徑促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移以及上調(diào)細(xì)胞VEGF的表達(dá),可以認(rèn)為PI3K/AKT與Hedgehog信號通路的功能密切相關(guān)。另一方面,阻滯Hedgehog信號通路可以明顯降低PI3K/AKT/NF-kB通路的活性。Rad51是放射線引起細(xì)胞DNA雙鏈斷裂后同源重組修復(fù)的特異性蛋白,其表達(dá)量升高往往伴隨著DNA損傷修復(fù)能力的加強(qiáng)。既往研究顯示,Rad51蛋白受PI3K/AKT調(diào)控,抑制PI3K/AKT信號途徑可以降低Rad51的表達(dá),并且另有研究已經(jīng)證明該蛋白在射線抗拒的HL60細(xì)胞系中呈高表達(dá)并與射線抵抗相關(guān),沉默該基因可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的射線抵抗,這也為Hedgehog通路阻滯劑逆轉(zhuǎn)難治性急性髓系白血病細(xì)胞放射線的抗拒提供了理論支持。Hedgehog信號通路在白血病治療中的作用日益受到重視。最近在一項關(guān)于成人急性髓細(xì)胞白血病的研究結(jié)果表明,Hedgehog信號通路的異常與白血病患者治療療效差密切相關(guān),并且可以作為預(yù)后不良因子之一；而另一項研究報告則顯示,特異性Hedgehog信號通路阻滯劑NVP-LDE225可以增加5氮雜胞苷的抗白血病細(xì)胞活性,基于此研究結(jié)果的臨床實驗也正在進(jìn)行。也有研究發(fā)現(xiàn),白血病細(xì)胞中Hedgehog信號通路表達(dá)越活躍,細(xì)胞的生存能力和耐藥性越高。這些研究均顯示了Hedgehog信號通路可以作為急性髓細(xì)胞白血病治療的一個新的靶點,但是有關(guān)該信號通路與急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞放射敏感性之間的關(guān)系,以及如何提高放射抗拒白血病細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)研究尚未見報道。因此在本研究中,我們假設(shè)Hedgehog信號通路與難治性急性髓系白血病細(xì)胞的放射線抗拒有關(guān),抑制該通路可以提高細(xì)胞的放射敏感性,從而為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究方法1.構(gòu)建放射耐受的HL60/RX細(xì)胞：采用小劑量遞增誘導(dǎo)照射方法,對HL60細(xì)胞株進(jìn)行逐漸增加照射劑量,構(gòu)建放射線抗拒的HL60細(xì)胞(HL60/RX細(xì)胞)。將HL60細(xì)胞、多藥耐藥的HL60/AD細(xì)胞株作為對照組細(xì)胞模型。2.HL60細(xì)胞、HL60/RX細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞的放射敏感性比較：通過克隆形成實驗觀察細(xì)胞對放射線的敏感參數(shù)(D0, Dq, SF2)、流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率和激光共聚焦顯微鏡觀察γ-H2AX方法,比較三種細(xì)胞對放射線損傷的敏感性差異。3. Hedgehog信號通路介導(dǎo)白血病細(xì)胞放射抗拒：為了明確Hedgehog通路是否介導(dǎo)了白血病細(xì)胞的放射線抗拒性,我們首先使用Western blot方法觀察三種細(xì)胞中Hedgehog通路關(guān)鍵因子SMO和Gli-1蛋白的表達(dá)。然后使用Hedgehog通路抑制劑—-NVP-LDE225,下調(diào)HL60/RX和HL60/ADR兩種細(xì)胞Gli-1水平,比較該通路阻滯后細(xì)胞放射敏感性變化,計算該藥物的放射增敏比(SER)。同時使用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡,分別觀察使用抑制劑后放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率和γ-H2AX表達(dá)水平。4.NVP-LDE225通過抑制Gli-1/PI3K/AKT/NF-kB途徑增加白血病細(xì)胞放射敏感性：為了探討NVP-LDE225對射線抗拒的白血病細(xì)胞放射增敏作用機(jī)理,我們將對射線抗拒的HL60/RX和HL60/ADR細(xì)胞分別分為4組：空白對照組、單用抑制劑組(10μmol/l)、單純照射組(4.8Gy照射)和聯(lián)合治療組(10μmol/L+4.8Gy照射)。使用Western blot方法觀察各組細(xì)胞治療后Gli-1、 pAKT、NF-kB、Rad51,和BAK表達(dá)水平；并通過激光共聚焦顯微鏡觀察NF-kB的核轉(zhuǎn)位情況。5. NVP-LDE225對裸鼠移植瘤放射增敏作用：6周齡BALB/c裸鼠在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng),用于構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。常規(guī)培養(yǎng)射線抗拒的HL60/RX細(xì)胞和多藥耐藥的HL60/ADR細(xì)胞,以1×107個細(xì)胞／只數(shù)量接種于裸鼠皮下,當(dāng)移植瘤大小約75-150 mm3作為成瘤標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行后續(xù)實驗。將兩種細(xì)胞的荷瘤鼠分別隨機(jī)分為4組：空白對照組常規(guī)飼養(yǎng),單用放療組使用4.8Gy進(jìn)行照射,單用藥物組使用NVP-LDE225 (80mg/kg/d,每日一次)灌胃處理,聯(lián)合治療組使用NVP-LDE225 (80mg/kg/d每日一次)灌胃,48小時后聯(lián)合4.8Gy照射處理。每日測量裸鼠腫瘤長短徑,按照公式：體積=0.5×長徑×短徑2計算腫瘤體積。放射治療后2周處死荷瘤鼠,手術(shù)摘除腫瘤稱重,標(biāo)本放入固定液待用,使用免疫組化方法研究信號蛋白表達(dá)水平。6.免疫組化觀察裸鼠移植瘤Gli-1, NF-kB, p-AKT,和BAK表達(dá)：將各組處理后的腫瘤組織石蠟切片,HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)并使用免疫組化方法觀察各組Gli-1,NF-kB, p-AKT和BAK表達(dá)水平。7.統(tǒng)計分析：以SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組獨立樣本比較使用T檢驗方法,多組資料比較使用單因素方差分析(ANOVA)。事后多重比較,如方差齊,使用Bonferroni檢驗；如方差不齊,則使用Dunnett's T3檢驗。P值0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.成功構(gòu)建對放射線抗拒的HL60/RX細(xì)胞：經(jīng)過12次小劑量遞增誘導(dǎo)照射,在末次劑量4.8Gy照射后,成功構(gòu)建了放射抗拒的白血病細(xì)胞株HL60/RX�？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明,HL60/RX和HL60/ADR細(xì)胞對放射線的耐受性明顯高于HL60細(xì)胞(P0.001)。HL60細(xì)胞的Dq、D0、SF2值為1.134±0.456 Gy, 1.282±0.271Gy和0.345±0.06; HL60/RX細(xì)胞的Dq、D0、SF2值為4.513±0.804Gy,3.033±0.29 Gy和0.814±0.04; HL60/ADR細(xì)胞的Dq、DO、SF2值為3.310±0.677 Gy,2.437±0.259 Gy和0.730±0.04。HL60細(xì)胞照射4.8Gy后的細(xì)胞凋亡率為61.0%,明顯高于HL60/RX (9.7%)和HL60/ADR (10.8%)(P0.001)。同時,放射抵抗的兩種細(xì)胞HL60/RX和HL60/ADR接受照射后的γ-H2AX表達(dá)明顯低于HL60細(xì)胞。2. Hedgehog信號通路活化介導(dǎo)白血病細(xì)胞對放射線抵抗的作用：Western blot檢測結(jié)果表明,表現(xiàn)為對放射線抗拒的HL60/RX和HL60/ADR兩種細(xì)胞,Hedegehog通路信號蛋白SMO和Gli-1的表達(dá)明顯高于HL60細(xì)胞(P0.001)。另一方面,克隆形成實驗結(jié)果顯示,使用阻滯劑NVP-LDE25降低Gli-1表達(dá)后,HL60/RX和HL60/ADR細(xì)胞表現(xiàn)出對放射線抵抗的能力明顯下降,該藥物對兩種細(xì)胞的放射增敏比分別為1.283 (HL60/ADR)和1.245 (HL60/RX)。另外,在使用Hedgehog通路抑制劑聯(lián)合放射治療48h后,聯(lián)合治療組總凋亡率分別達(dá)到68.2%(HL60/ADR)和60.8%(HL60/RX),明顯高于未使用抑制劑組(P0.001)；激光共聚焦顯微鏡觀察到聯(lián)合治療組y-H2AX表達(dá)水平明顯高于單用放療組(P0.001)。由此可以證明,Hedgehog信號通路介導(dǎo)了難治性急性白血病細(xì)胞的射線抵抗特性。3. Hedgehog信號通路阻斷劑能夠逆轉(zhuǎn)HL60/RX和HL60/ADR細(xì)胞放射線抵抗：既往有研究證明,PI3K/AKT/NF-kB可以提高細(xì)胞放射抵抗能力。本研究結(jié)果顯示,在使用NVP-LDE225 48小時后,HL60/ADR和HL60/RX細(xì)胞中Gli-1的表達(dá)水平明顯低于對照組(p0.001),同時pAKT蛋白表達(dá)水平也隨之明顯低于對照組(p0.001),證明了Hedgehog信號通路中的Gli-1蛋白能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT活性。同時激光共聚焦顯微鏡觀察以及Western blot結(jié)果均表明,HL60/ADR細(xì)胞和HL60/RX細(xì)胞的NF-kB蛋白在細(xì)胞接受照射后出現(xiàn)明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,細(xì)胞核內(nèi)含量明顯升高(p0.001),提示在細(xì)胞照射后NF-kB活性升高,可發(fā)揮其核轉(zhuǎn)錄因子作用促進(jìn)細(xì)胞射線抵抗功能；但是當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過Hedgehog通路阻滯劑處理后,再受到射線暴露時,NF-kB核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象明顯減弱,從而證明Hedgehog通路阻斷劑可以通過下調(diào)NF-kB活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增加射線敏感性。我們也觀察到在單純照射組,因為細(xì)胞具有較高的Gli-1/PI3K/AKT/NF-kB活性,相應(yīng)的促凋亡蛋白BAK在照射后處于較低水平；但是在使用抑制劑后聯(lián)合放射治療組,促凋亡蛋白BAK在細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于空白對照組、單用藥物組和單純放射組(p0.001),此結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)觀察到的本組細(xì)胞高凋亡率相一致,顯示了該藥物具有增加射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。Rad51是細(xì)胞受到射線照射后,DNA損傷發(fā)生同源重組修復(fù)的關(guān)鍵蛋白,并可以通過PI3K/AKT信號進(jìn)行調(diào)控。本研究結(jié)果顯示,HL60/RX細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞在受到照射后,Rad51表達(dá)明顯高于對照組(p0.001),提示該蛋白可以促進(jìn)治療抗拒的白血病細(xì)胞射線損傷修復(fù)功能；但是在應(yīng)用Hedgehog通路阻滯劑后再行照射時,Rad51表達(dá)未見升高。此結(jié)果提示在Hedgehog高表達(dá)的細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞接受照射后,具有較高的損傷修復(fù)能力,但是在Hedgehog通路阻滯后,這種損傷修復(fù)能力明顯下降。4.Hedgehog通路阻斷劑在HL60/RX和HL60/ADR裸鼠移植瘤模型體內(nèi)靶向治療作用：在本研究中,我們成功構(gòu)建了HL60/ADR和HL60/RX的裸鼠移植瘤模型用于動物實驗。結(jié)果表明,NVP-LDE225聯(lián)合放射治療組腫瘤細(xì)胞生長速度明顯慢于空白對照組、單用NVP-LDE225組和單純照射組(p0.001)。雖然單用NVP-LDE225組和單純照射組腫瘤生長速度略低于空白對照組,但無統(tǒng)計學(xué)差別。與之相應(yīng),在各組處理后14天,聯(lián)合治療組移植瘤重量明顯低于其他三組(p0.001)。病理HE染色觀察到聯(lián)合治療組比其他三組組織壞死面積增大。免疫組化結(jié)果與體外實驗一致,無論是HL60/RX細(xì)胞移植瘤還是HL60/ADR細(xì)胞移植瘤,在使用NVP-LDE225處理后,Gli-1表達(dá)明顯下降,而且pAKT和細(xì)胞核中NF-kB蛋白表達(dá)明顯下降。聯(lián)合治療組腫瘤組織中BAK蛋白呈高表達(dá),明顯高于其他三組；而空白對照組與單用藥物組、單純放療組BAK蛋白表達(dá)無差異。動物實驗結(jié)果也證明了Hedgehog通路阻滯可以增加對放射線或化療抗拒的白血病細(xì)胞的放射敏感性,其作用機(jī)制可能是與調(diào)節(jié)Gli-1/pAKT/NF-kB途徑有關(guān)。結(jié)論1.HL60/ADR細(xì)胞和HL60/RX細(xì)胞中Hedgehog信號通路表達(dá)明顯高于HL60細(xì)胞。相對應(yīng)的,HL60/ADR細(xì)胞和HL60/RX細(xì)胞比HL60細(xì)胞具有較強(qiáng)的放射線抵抗能力,在抑制Hedgehog信號通路后這種抵抗能力明顯下降。2. HL60/ADR細(xì)胞和HL60/RX細(xì)胞在接受放射線照射后具有較強(qiáng)的射線損傷修復(fù)和抗凋亡能力,在抑制Hedgehog信號通路后對放射線的損傷修復(fù)能力下降,凋亡升高。3.體外實驗和動物實驗表明,Hedgehog信號通路介導(dǎo)的放射線抵抗有可能是通過Gli-1/PI3K/AKT/NF-kB途徑進(jìn)行的,應(yīng)用Hedgehog信號通路抑制劑能夠靶向逆轉(zhuǎn)抵抗射線的作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Sonic hedgehog protein promotes bone marrow-derived endothelial pro-genitor cell proliferation,migration and VEGF production via PI 3-kinase/Akt signaling pathways[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年06期

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本文編號：2435136