【摘要】：慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia,CLL)在西方發(fā)達(dá)國(guó)家中發(fā)病率很高。隨著我們對(duì)CLL病因和疾病發(fā)展認(rèn)識(shí)的不斷深入,治療的手段逐漸傾向于開(kāi)發(fā)一類靶向CLL惡性B細(xì)胞關(guān)鍵酶類的化學(xué)藥物,而對(duì)于這些藥物的作用機(jī)制和對(duì)免疫系統(tǒng)的影響還需要深入研究。另外,腫瘤微環(huán)境的形成與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞群有關(guān),Nurse like cells(NLCs)是具有M2表型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,可促進(jìn)CLL惡性B淋巴細(xì)胞(B-CLL)存活并保護(hù)B-CLL免于自發(fā)性或抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。如何極化腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞NLCs、使其由M2表型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂姓Ｃ庖吖δ艿腗1表型免疫效應(yīng)細(xì)胞,由此增強(qiáng)單克隆抗體免疫治療中抗體對(duì)B-CLL的殺傷與清除也是目前的研究熱點(diǎn)。Ibrutinib,是一種不可逆的靶向于Bruton酪氨酸激酶(Btk)的抑制劑類化學(xué)藥物,目前已經(jīng)用于治療如B-CLL和B-細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤等B淋巴細(xì)胞癌。巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表達(dá)的Fcγ受體(FcγR)在腫瘤特異性抗體介導(dǎo)的涉及Btk信號(hào)通路的免疫應(yīng)答中具有重要作用。本論文第二章研究了Ibrutinib在單核/巨噬細(xì)胞FcγR所介導(dǎo)的免疫活動(dòng)中的作用。研究發(fā)現(xiàn)即使高濃度的Ibrutinib也不影響單核/巨噬細(xì)胞FcγR介導(dǎo)的吞噬作用,卻會(huì)抑制FcγR介導(dǎo)的炎癥因子的釋放,同樣的現(xiàn)象我們也從Btk突變小鼠分離得到的巨噬細(xì)胞中得到了驗(yàn)證。鈣流(calcium flux)是Btk最主要的下游信號(hào)分子,我們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子、蛋白酶磷酸化及吞噬作用詳細(xì)闡述了鈣流變化對(duì)免疫反應(yīng)的影響,結(jié)果顯示抑制細(xì)胞內(nèi)鈣流會(huì)降低FcγR介導(dǎo)的炎癥因子的釋放,但卻不影響單核/巨噬細(xì)胞FcγR介導(dǎo)的吞噬作用,這說(shuō)明Ibrutinib通過(guò)減少胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子水平下降。我們進(jìn)一步探討了Ibrutinib只抑制炎癥反應(yīng)卻不影響吞噬作用的原因,在單核/巨噬細(xì)胞中,小G蛋白(GTPase)Rac負(fù)責(zé)肌動(dòng)蛋白的聚合和細(xì)胞骨架重排,是免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用所必須的關(guān)鍵激酶。研究結(jié)果顯示無(wú)論Ibrutinib還是Btk下游的鈣離子均不影響Rac的活化,這說(shuō)明Ibrutinib不影響吞噬作用的原因是Rac信號(hào)通路的活化不受Ibrutinib影響,進(jìn)而推測(cè)Rac與Btk分別作用于兩條信號(hào)通路。所以,抑制Btk后胞內(nèi)鈣離子水平降低、細(xì)胞因子水平下降,但由于Rac活性不受抑制,所以吞噬作用不受影響。關(guān)于Bt K抑制劑Ibrutinib的藥物作用效果和特異性研究顯示Bt K與TLR8信號(hào)通路的激活密切相關(guān),但不參與TLR4的活化。RNA和蛋白水平檢測(cè)不同的FcγR與Btk磷酸化的相關(guān)性,結(jié)果顯示FcγRIIa(CD32)主要介導(dǎo)Btk的磷酸化。單克隆抗體免疫治療B-CLL是臨床上廣泛采用的治療手段,FcγR在抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中不可或缺,且免疫效應(yīng)細(xì)胞與抗體包被的靶癌癥細(xì)胞所形成的免疫復(fù)合物直接啟動(dòng)并誘導(dǎo)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而消滅腫瘤細(xì)胞。鑒于Ibrutinib抗炎卻不影響機(jī)體的免疫功能,論文的第三章研究了Ibrutinib與單克隆抗體協(xié)同治療的可行性。NK細(xì)胞大量分泌的干擾素-γ(IFN-γ)既可以殺傷抗體標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞,還可以抵消Ibrutinib對(duì)單核/巨噬細(xì)胞FcγR所介導(dǎo)的炎癥因子的影響。針對(duì)IFN-γ作用機(jī)制的研究結(jié)果顯示IFN-γ可以活化FcγR介導(dǎo)的下游Erk信號(hào)通路,克服Ibrutinib對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞Erk信號(hào)通路所造成的抑制作用。單核/巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)、模擬體內(nèi)免疫效應(yīng)細(xì)胞間相互作用的研究中,Ibrutinib表現(xiàn)出既不抑制FcγR介導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生,對(duì)免疫細(xì)胞的免疫功能也沒(méi)有明顯的副作用。綜上,激酶抑制劑Ibrutinib只殺傷慢性淋巴細(xì)胞白血病的惡性B細(xì)胞,對(duì)巨噬細(xì)胞沒(méi)有明顯的副作用,Ibrutinib與單克隆抗體協(xié)同可治療增強(qiáng)B-CLL的治療效果。含有腫瘤細(xì)胞和炎性因子的CLL腫瘤微環(huán)境支持惡性B淋巴細(xì)胞的存活。CD14~+單核/巨噬細(xì)胞與B-CLL體外共培養(yǎng)會(huì)分化形成形狀大且圓的貼壁細(xì)胞,科研人員將這類為B-CLL提供養(yǎng)分且支持其存活的細(xì)胞定義為Nurse like cells(NLCs)。IFN-γ具有誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化的作用,本論文的第四章闡述了IFN-γ極化NLCs的M2表型、將其轉(zhuǎn)變?yōu)镸1表型的巨噬細(xì)胞,從而促進(jìn)細(xì)胞因子釋放、提高細(xì)胞吞噬作用能力并有助于抗體對(duì)B-CLL的清除。流式細(xì)胞儀標(biāo)記實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)結(jié)果顯示IFN-γ增強(qiáng)NLCs M1巨噬細(xì)胞表型相關(guān)基因CD80和CD86的表達(dá),下調(diào)與M2表型相關(guān)基因CD206的表達(dá)。此外,IFN-γ處理NLCs后活化型受體FCγRⅠ的表達(dá)水平升高,細(xì)胞吞噬作用能力增強(qiáng),抗體介導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的清除效果得到顯著提升。細(xì)胞活力MTT檢測(cè)結(jié)果表明IFN-γ處理NLCs會(huì)增強(qiáng)藥物對(duì)B-CLL的毒性作用,同時(shí)會(huì)減少B-CLL惡性腫瘤細(xì)胞的存活。單核/巨噬細(xì)胞在CLL腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的影響下逐漸極化為具有TAM功能的NLCs,我們采用IFN-γ來(lái)重塑NLCs并使其極化為具有抗癌表型的正常免疫效應(yīng)細(xì)胞,上述結(jié)果說(shuō)明IFN-γ具有和單克隆抗體協(xié)同治療CLL的潛力。本論文首次針對(duì)Ibrutinib這種Btk抑制劑類藥物對(duì)單核/巨噬細(xì)胞FcγR介導(dǎo)的免疫功能的影響及相應(yīng)分子機(jī)制進(jìn)行了詳盡闡述,闡明了Ibrutinib與單克隆抗體協(xié)同治療CLL的可行性及臨床應(yīng)用潛力。我們還研究了IFN-γ極化NLCs為M1型巨噬細(xì)胞的過(guò)程中相關(guān)標(biāo)志分子的變化,研究說(shuō)明IFN-γ可阻斷NLCs為B-CLL提供養(yǎng)分,極化后的NLCs可通過(guò)吞噬作用殺傷腫瘤細(xì)胞。Ibrutinib這類激酶靶向抑制劑類藥物以及細(xì)胞因子IFN-γ與單克隆抗體類藥物聯(lián)合治療CLL具有廣泛的臨床應(yīng)用潛力,進(jìn)一步明確IFN-γ的胞內(nèi)釋放途徑和作用機(jī)制,提高免疫效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ的生產(chǎn)能力,進(jìn)而阻止CLL腫瘤微環(huán)境的形成將是接下來(lái)需要深入研究的內(nèi)容。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.72
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本文編號(hào)：2434289