【摘要】：肝臟腫瘤是全球第五大常見癌癥和引起死亡的第三大疾病。肝臟腫瘤在我國(guó)發(fā)病率越來越高,化療中的多藥耐藥導(dǎo)致的高復(fù)發(fā)率使患者難以長(zhǎng)期生存,對(duì)于不能手術(shù)治療的中晚期患者,目前還沒有有效的治療手段。近年來大量事實(shí)證明肝腫瘤是由肝腫瘤干細(xì)胞(LCSC)所引發(fā),肝腫瘤干細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物的耐藥性和放射療法不敏感,治療后殘余的腫瘤干細(xì)胞會(huì)分化增殖,因此,肝腫瘤干細(xì)胞在肝腫瘤治療和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵性作用。要想達(dá)到根治肝腫瘤的的目的,需要同時(shí)徹底清除肝腫瘤細(xì)胞和肝腫瘤干細(xì)胞。蘿卜硫素(1-異硫氰酸-4-甲磺�；⊥�,英文名Sulforaphane,SFN),在西蘭花、甘藍(lán)、蘿卜等十字花科類植物中含量較高,能夠抑制Ⅰ相P450細(xì)胞色素酶,誘導(dǎo)Ⅱ相金屬還原酶,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡,可選擇性作用于多種腫瘤干細(xì)胞。甲苯磺酸索拉菲尼(4-{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)酰脲]苯氧基}吡啶-2-甲酰胺對(duì)甲苯磺酸鹽,英文名Sorafenib tosylate,ST)是一種多靶點(diǎn)的口服抑制劑,能抑制VEGFR、PDGFR、KIT等受體酪氨酸激酶活性,還可以抑制RAF激酶活性,既可作用于腫瘤細(xì)胞又可作用于腫瘤血管,能夠顯著改善晚期肝腫瘤患者的生存狀態(tài),是目前臨床上肝腫瘤治療的一線藥物。為了達(dá)到同時(shí)殺傷肝腫瘤普通細(xì)胞和肝腫瘤干細(xì)胞的目的,本課題設(shè)計(jì)了載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(SFN/MSN/LIPs)和載甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(ST/MSN/LIPs)。借助高效液相色譜技術(shù)建立了蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的含量測(cè)定方法。蘿卜硫素的線性方程為:A=40,238,415C+57,864(R2=0.9993),線性范圍為:2.52～161.50μg?mL-1。甲苯磺酸索拉菲尼的特異性良好,線性方程為:A=88885C+45916(R2=0.999),線性范圍為:1.96～125.38μg?mL-1。經(jīng)考察,蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的體外HPLC測(cè)定方法的特異性、線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度、精密度均符合體外測(cè)定要求,可用于蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的體外含量測(cè)定,為蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼在藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)中包封率、載藥量以及體外釋放度的測(cè)定建立了良好的基礎(chǔ)。在已有文獻(xiàn)研究和課題組前期工作的基礎(chǔ)上,制備了介孔二氧化硅納米粒。通過降低分散介質(zhì)的pH,減少了納米粒子的聚集,再借助超聲破碎儀或微射流超高壓納米均質(zhì)機(jī)將納米粒分散細(xì)化,提高了體系的穩(wěn)定性,使納米粒子的氨基化更均勻。納米粒經(jīng)氨基化后,在中性條件下就能保持很好的分散性,為下一步制備ph響應(yīng)型的載體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。采用激光納米粒度測(cè)定儀,掃描電子顯微鏡(sem),透射電子顯微鏡(tem)對(duì)載體介孔結(jié)構(gòu)、分散狀況、表面形態(tài)、粒徑分布、zeta電位等性質(zhì)進(jìn)行表征。采用氮?dú)馕?脫附法對(duì)載體的比表面積、孔徑和孔容積進(jìn)行了考察。結(jié)果表明:(1)采用表面活性劑模板法(surfactanttemplatemethod)制備的介孔二氧化硅納米粒,粒徑在100nm左右,粒徑均一性好,呈球形,bet多點(diǎn)比表面積為709.24m2?g-1,bjh吸附累積總孔體積為0.71cm3?g-1,bjh吸附平均孔徑為4.69nm,且具有較窄的孔徑分布。(2)對(duì)msn表面用aeptms進(jìn)行氨基化修飾,制備了氨基化的msn(msn-nh2),在不改變介孔結(jié)構(gòu)的前提下,改善了msn的分散性,(3)將載藥的msn包裹于由二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和二油酰磷脂酰膽堿(dopc)及膽固醇(cholesterol)共同組成的ph敏感脂質(zhì)體中,利用了ph敏感脂質(zhì)體的特性,在中性條件下,羧基質(zhì)子化,磷脂材料的立體形狀呈倒置圓錐體,(即親水段大而親油端小),彌補(bǔ)了dope的立體缺陷(立體結(jié)構(gòu)呈圓錐狀,但親水端小而親油端大),形成穩(wěn)定的脂質(zhì)雙分子層膜,在酸性條件下,羧基質(zhì)子化,親水端體積變小,失去對(duì)dope的補(bǔ)缺作用,類生物膜結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定,最終與生物膜融合而釋放藥物。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向治療作用。(4)通過采用透析管方式考察載體對(duì)藥物在不同ph條件下的釋放行為,來推測(cè)載體在體內(nèi)可能出現(xiàn)的釋放情況。結(jié)果表明,藥物的釋放具ph依賴性,在ph=7.4(生理?xiàng)l件)下,藥物釋放相對(duì)較慢,而在ph=5.0(腫瘤內(nèi)環(huán)境)條件下,釋放速度加快,且趨于完全釋放,這有助于發(fā)揮藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用。在課題組已有研究工作的基礎(chǔ)上,本文采用無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù),成功篩選分離出hepg2微球體,作為研究肝腫瘤干細(xì)胞的模型。在此基礎(chǔ)上,考察了蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼對(duì)肝腫瘤細(xì)胞hepg2細(xì)胞系和肝腫瘤干細(xì)胞hepg2微球體的殺傷作用,并進(jìn)一步考察了對(duì)肝腫瘤干細(xì)胞hepg2細(xì)胞系和hepg2微球體的聯(lián)合殺傷作用。結(jié)果表明:(1)對(duì)hepg2細(xì)胞系,當(dāng)蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼摩爾比例為1:5、1:10、1:20時(shí),聯(lián)合作用指數(shù)ci值小于1,均表現(xiàn)為協(xié)同作用;兩藥比例為20:1、10:1、5:1、1:1時(shí),在低濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)ci值小于1,表現(xiàn)為協(xié)同作用,而在高濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)ci值大于1,表現(xiàn)為拮抗作用。(2)對(duì)hepg2微球體,當(dāng)蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼摩爾比例為5:1、1:1、10:1、20:1時(shí),在低濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)ci值小于1,表現(xiàn)為協(xié)同作用,而在高濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)ci值大于1,表現(xiàn)為拮抗作用;當(dāng)兩藥比例為1:5、1:10、1:20時(shí),聯(lián)合作用指數(shù)ci均小于1,表現(xiàn)為協(xié)同作用。由于sfn毒性作用較低,最終優(yōu)選出二者的給藥比例為1:5(在此比例下對(duì)hepg2細(xì)胞系和hepg2-ms均具有協(xié)同作用)。為處方設(shè)計(jì)和后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。借助流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡考察了肝腫瘤細(xì)胞對(duì)介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體的攝取。從流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果可以看出,空白載體(msn/lips)組的熒光強(qiáng)度較未處理組細(xì)胞無顯著性差異,蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼(sfn+st)聯(lián)用組和sfn/msn/lips+st/msn/lips組的熒光值顯著高于未處理組,sfn/msn/lips+st/msn/lips組的熒光值又顯著高于sfn+st組,說明sfn/msn/lips+st/msn/lips組中進(jìn)入hepg2細(xì)胞的藥物量高于sfn+st組,說明載體對(duì)肝癌hepg2細(xì)胞和hepg2微球體均具有一定靶向性。激光共聚焦顯微鏡直觀觀察肝腫瘤細(xì)胞與介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體的作用過程。結(jié)果表明,在腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞的作用下,載體可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并完成藥物釋放,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞靶向給藥。介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體對(duì)肝腫瘤細(xì)胞具有一定的靶向性。實(shí)驗(yàn)還考察了載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(sfn/msn/lips)和載甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(st/msn/lips)以優(yōu)選比例給藥,對(duì)肝腫瘤hepg2細(xì)胞和hepg2微球體的殺傷作用。結(jié)果顯示,與二者游離藥物以優(yōu)選比例給藥相比,作用有顯著性差異(p0.05)。說明納米載體對(duì)肝腫瘤hepg2細(xì)胞和hepg2微球體具有一定靶向性。建立了人肝腫瘤hepg2細(xì)胞裸鼠移植模型,在此基礎(chǔ)上,以裸鼠腫瘤體積變化曲線、體重改變、腫瘤的重量差異、腫瘤抑制率、離體腫瘤細(xì)胞再培養(yǎng)微球體成球率等為指標(biāo)考察了載藥介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體在動(dòng)物體內(nèi)的抗腫瘤效果。體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明,空白藥物載體msn/lips組與生理鹽水組相比,無顯著性差異(p0.05);體重變化率均無體重下降現(xiàn)象,說明msn/lips及載藥msn/lips用于治療肝腫瘤無明顯的毒副作用,可用于肝腫瘤的治療。甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體組(st/msn/lips)及載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)和載甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體聯(lián)用組(sfn/msn/lips+st/msn/lips),與其他組相比,具有顯著性差異(p0.05),說明藥物聯(lián)用優(yōu)于藥物單獨(dú)使用,更優(yōu)于兩種游離藥物的聯(lián)用和單獨(dú)使用,提示載荷藥物的介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體聯(lián)用通過高載藥量、pH敏感釋放和納米尺度的EPR效應(yīng)可同時(shí)提高對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用。裸鼠體內(nèi)抗肝癌干細(xì)胞活性研究的結(jié)果表明,藥物處理組與生理鹽水組相比,微球體的直徑偏小,微球體形成率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),說明SFN和ST對(duì)肝腫瘤干細(xì)胞均有作用;載體聯(lián)用組與游離藥物聯(lián)用組相比,微球體形成率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),說明SFN和ST經(jīng)MSN/LIPs包載后,可以同時(shí)作用于肝腫瘤細(xì)胞和肝腫瘤干細(xì)胞,增強(qiáng)了體內(nèi)抗腫瘤活性。綜上所述,本課題研究設(shè)計(jì)的載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體和載甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體載體系統(tǒng)與其它納米給藥系統(tǒng)相比可以提高對(duì)兩種藥物載藥量,提高藥物的穩(wěn)定性和分散性。SFN/MSN/LIPs與ST/MSN/LIPs聯(lián)用,可以同時(shí)作用于肝腫瘤細(xì)胞和肝腫瘤干細(xì)胞,其抗肝腫瘤活性優(yōu)于兩種藥物溶液劑單用組、聯(lián)用組和兩種不同載藥的介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體單用組,期望該介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體載體系統(tǒng)可作為肝腫瘤治療的有效手段,為肝腫瘤臨床治療提供新方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2426921