【摘要】：目的腸癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要疾病之一。腸癌的主要癌前疾病是腸道腺瘤(約占全部腸癌癌前疾病的90%~95%),腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,Apc)的突變普遍被認為是腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件。臨床發(fā)現(xiàn),高脂飲食可導(dǎo)致肝臟合成膽汁酸的底物(膽固醇)增加,進而引發(fā)腸腔中膽汁酸流量增加,過量的膽汁酸無法全部在回盲部通過腸肝循壞回吸收,而是會有部分進入結(jié)腸。最新研究還發(fā)現(xiàn)高脂飲食可誘導(dǎo)腸道菌群失衡,引起多種顯著的腸道菌群豐度改變及機體內(nèi)環(huán)境紊亂。初級膽汁酸膽酸(cholic aicd,CA)是人類最主要膽汁酸之一,一方面,其代謝受到腸道菌群的影響,另一方面,其代謝產(chǎn)物也影響著腸道菌群,而腸道菌群與膽汁酸的相互作用在腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不完全明確。本研究以能自發(fā)形成腸道腺瘤的Apcmin/+小鼠為模型,探討在腸道腺瘤惡變過程中膽汁酸與腸道菌群的相互作用。方法第一部分:為了探討CA對Apcmin/+小鼠腸道腺瘤惡變的作用,我們以4周齡Apcmin/+小鼠為研究對象,分為膽酸組(飲食中添加0.4%CA)和對照組(普通飲食),飼養(yǎng)周期為12周,處死小鼠,分離全部腸道組織,分段記錄腺瘤數(shù)量及大小,病理學(xué)評估腺瘤惡變情況;Realtime-PCR、免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠腸道單核-巨噬系統(tǒng)改變;免疫組織化學(xué)觀察腺瘤惡變過程中Wnt信號通路關(guān)鍵信號分子表達的變化。第二部分:飼養(yǎng)12周后,處死小鼠前給予小鼠FITC-D灌胃,采取眼球血檢測血清FITC-D濃度以評價腸道通透性,收集新鮮糞便進行腸道菌群16S r RNA測序及色譜法檢測各種膽汁酸水平;處死小鼠,采取回盲部糞便色譜法檢測短鏈脂肪酸水平;Realtime-PCR、免疫組織化學(xué)染色評價腸道緊密連接蛋白、杯狀細胞及潘氏細胞功能;Realtime-PCR檢測腸道炎癥水平。第三部分:為評價抗生素去除腸道菌群對CA誘導(dǎo)Apcmin/+小鼠腸癌的阻斷作用,我們對膽酸組小鼠同時給予抗生素雞尾酒(萬古霉素100mg/L、氨芐西林200mg/L、新霉素200mg/L和甲硝唑200mg/L)以去除腸道菌群作用,余實驗動物處理同上,此時實驗動物為三組:膽酸組,膽酸+抗生素組,對照組,12周后處死小鼠,計數(shù)腸道腺瘤數(shù)目及大小,病理學(xué)組織學(xué)觀察腺瘤惡變情況,RealtimePCR檢測腸道炎癥。第四部分:為深入研究膽酸及其導(dǎo)致的腸道菌群改變對IL-6/STAT3信號通路的影響,我們應(yīng)用Realtime-PCR、免疫組織化學(xué)染色檢測以上三組IL-6/STAT3通路關(guān)鍵信號分子的變化;同時為進一步驗證假設(shè),我們以結(jié)腸癌前細胞系IMCE為研究對象,Western blot方法探索IL-6/STAT3通路及其下游關(guān)鍵分子的變化。結(jié)果第一部分(1)實驗周期12周后膽酸組小鼠腸道腫瘤數(shù)量明顯增加約2倍,腫瘤數(shù)量增多主要出現(xiàn)在中段和遠段小腸,小腸各種大小的腺瘤均增加(1mm,1-2mm,2mm),大腸大腺瘤數(shù)量增多。此外,病理學(xué)染色顯示CA組小鼠腸道腺瘤發(fā)生惡變,在遠端小腸,80%出現(xiàn)高級別上皮內(nèi)瘤變,而對照組僅為腺瘤伴或不伴有低級別上皮內(nèi)瘤變。Apcmin/+膽酸組小鼠腸道腫瘤Ki-67及β連環(huán)蛋白陽性細胞百分比較對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)膽酸組Apcmin/+小鼠巨噬細胞招募顯著增加,腸道腫瘤組織間質(zhì)巨噬細胞的M2型表面分子比例增多,而M1型表面分子比例減少,提示組織存在惡性轉(zhuǎn)化趨勢。(3)膽酸上調(diào)Apcmin/+小鼠Wnt通路,腸組織E-cadherin和β-catenin表達情況與對照組相比存在顯著差異,E-cadherin在細胞膜上的表達減少,β-catenin在細胞漿中表達增加且部分細胞出現(xiàn)細胞核的濃集,Cyclin D1在細胞漿中的表達亦增加。第二部分(1)CA誘導(dǎo)腸道微生態(tài)失衡,具體表現(xiàn)為致病菌(如普沃氏菌屬、埃希志賀菌屬、脫硫弧菌屬,還包括一些條件致病菌,如Akkermansia、Bacteroides等菌屬)明顯增加,益生菌(如乳桿菌、雙歧桿菌、產(chǎn)丁酸菌等)明顯減少,同時CA致使小鼠腸道菌群多樣性發(fā)生明顯降低。(2)膽酸組Apcmin/+小鼠回盲部短鏈脂肪酸(包括乙酸、丙酸、丁酸)的水平明顯低于對照組。(3)Apcmin/+膽酸組小鼠血清FITC-D濃度明顯高于對照組,提示膽酸處理Apcmin/+小鼠會使其腸道通透性明顯增加。同時,膽酸組緊密連接蛋白ZO-1、Claudin3、Claudin7的m RNA相對表達量明顯高于對照組,PAS染色、MUC 2、defensin、cryptdin免疫組化染色及基因表達提示CA導(dǎo)致杯狀細胞及潘氏細胞功能受損。(4)膽酸組Apcmin/+小鼠腸道發(fā)生低度炎癥,實時熒光定量PCR顯示小鼠腸道上皮細胞IL-1β、IL-6及TNF-α相對表達量較對照組明顯升高。(5)膽酸組Apcmin/+小鼠腸道膽汁酸水平明顯高于對照組,主要表現(xiàn)為進食性DCA水平的增加。第三部分(1)試驗周期12周后,膽酸+抗生素組Apcmin/+小鼠腸道腺瘤數(shù)目及大小較膽酸組明顯降低,病理組織學(xué)顯示膽酸+抗生素組小鼠腸道腫瘤均為管狀腺瘤,惡性度低于膽酸組和對照組。(2)膽酸+抗生素組Apcmin/+小鼠腸道炎癥水平較膽酸組和對照組相比大幅降低。第四部分(1)小鼠腸道組織免洗組織化學(xué)染色顯示,小鼠腸道IL-6、STAT3、p-STAT3表達明顯增加。(2)膽酸組小鼠糞菌液刺激IMCE細胞系,炎癥因子水平增加,上調(diào)IL-6/STAT3通路信號分子及其下游關(guān)鍵分子。結(jié)論本文揭示了膽汁酸與腸道菌群的相互作用對腸道腺瘤進展過程的影響,一些可能與腸道炎癥相關(guān)的細菌,如Akkermansia,等可能是促發(fā)腺瘤惡變過程的因素之一,此外,腸道中保護性SCFAs水平的降低,膽汁酸水平的增加及STAT3等腫瘤相關(guān)信號通路的活化等均參與其中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.3

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本文編號：2425545