【摘要】：第一部分 miR-452在肝癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞和肝癌組織中的表達(dá)及其臨床病理意義目的既往的文獻(xiàn)報(bào)道中,miR-452在惡性腫瘤中的表達(dá)模式不盡一致。同時(shí),miR-452對(duì)肝癌細(xì)胞尤其是肝癌腫瘤干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚不明確。本研究旨在明確miR-452在肝癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞和組織中的表達(dá)模式,并進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析miR-452表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理因素以及預(yù)后的關(guān)系。方法本部分我們利用無(wú)血清培養(yǎng)法聯(lián)合阿霉素和索拉菲尼,連續(xù)傳代培養(yǎng)篩得耐藥的肝癌細(xì)胞球,接著對(duì)上述獲得的肝癌細(xì)胞進(jìn)行了干性鑒定。進(jìn)一步利用qPCR方法檢測(cè)在富集的肝癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中miR-452的表達(dá)水平。同時(shí)利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)肝癌臨床樣本中miR-452的表達(dá)水平。結(jié)果QPCR結(jié)果顯示耐藥肝癌細(xì)胞球細(xì)胞干性相關(guān)基因表達(dá)明顯升高。流式檢測(cè)顯示CD44、CD133、CD90、EpCAM等肝癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記分子比例明顯升高。皮下成瘤能力也明顯增強(qiáng)。因此,利用無(wú)血清培養(yǎng)基聯(lián)合阿霉素和索拉菲尼篩選獲得的耐藥肝癌細(xì)胞懸浮球細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性。進(jìn)一步的原位雜交結(jié)果顯示,肝癌組織的miR-452表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高。并且生存分析結(jié)果顯示miR-452的表達(dá)水平與肝癌術(shù)后患者的總體生存率成顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論本研究證實(shí)了利用無(wú)血清培養(yǎng)法聯(lián)合阿霉素和索拉菲尼可以篩選獲得腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。并且miR-452在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)明顯高于貼壁分化細(xì)胞。miR-452在肝癌細(xì)胞系和肝癌組織中表達(dá)水平明顯升高。肝癌組織中miR-452的表達(dá)水平與肝癌患者的總體生存率呈明顯負(fù)相關(guān),明確了miR-452對(duì)于臨床肝癌術(shù)后患者的預(yù)后判斷價(jià)值。第二部分 MiR-452對(duì)肝癌腫瘤干細(xì)胞樣特性的作用及其分子機(jī)制研究目的第一部分研究結(jié)果提示,miR-452很可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的生物學(xué)作用,并且miR-452很有可能通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞樣特性來(lái)促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。方法本部分中,我們利用慢病毒過(guò)表達(dá)和敲低了miR-452,然后分別檢測(cè)了肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞樣相關(guān)特性,包括耐藥能力、干性相關(guān)基因的表達(dá)、自我更新能力、體內(nèi)成瘤能力以及轉(zhuǎn)移能力等。接著通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)并利用雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)和western blot以及補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-452的直接靶基因。TOPFlash和FOPFlash雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。進(jìn)一步的熒光共定位和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SOX7可以與β-catenin和TCF4之間的相互作用。結(jié)果過(guò)表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-452可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞樣特性。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)和western blot證實(shí)了Sox7為miR-452的直接靶基因。TOPFlash和FOPFlash雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOX7可以劑量依賴(lài)性的抑制Wnt/p-catenin信號(hào)通路的活性。進(jìn)一步的熒光共定位和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了SOX7可以與β-catenin和TCF4發(fā)生直接的相互作用。結(jié)論MiR-452可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的耐藥性、干性相關(guān)基因表達(dá)、成球能力、體外遷移和侵襲能力、體內(nèi)的皮下成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性。在肝癌細(xì)胞中,Sox7是miR-452的直接作用靶基因。SOX7在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織；并且在肝癌組織中SOX7低表達(dá)的肝癌患者預(yù)后明顯較差,是肝癌患者術(shù)后長(zhǎng)期生存的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn),MiR-452通過(guò)直接抑制Sox7基因從而活化了Wnt/β-catenin信號(hào)通路,引起β-catenin依賴(lài)的重編程,最終促進(jìn)了肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞樣特性生長(zhǎng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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