【摘要】：端粒酶(telomerase)是能以自身RNA為模板合成端粒DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶,其主要作用是維持染色體末端端粒(telomere)的長度以保持染色體的穩(wěn)定性。人端粒酶主要由兩個部分組成,人端粒酶RNA模板(human telomerase RNA, hTR)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。研究證實,端粒酶與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,而在這個過程中,hTERT作為端粒酶的限速酶發(fā)揮了關(guān)鍵作用,但是其表達(dá)調(diào)控機制尚不完全明確。本論文主要從以下三個方面研究hTERT啟動子在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控機制及其在腫瘤診斷中的潛在應(yīng)用：(1)hTERT啟動子DNA甲基化,(2)hTERT啟動子突變,(3)hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。第一部分hTERT啟動子DNA甲基化在胃腸道惡性腫瘤診斷中的研究背景胃腸道惡性腫瘤(gastrointestinal cancer,GIC),主要包括胃癌(gastric cancer, GC)和結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC),是最常見的惡性腫瘤之一。目前內(nèi)鏡活檢是診斷GIC的主要手段,但是內(nèi)鏡檢查是有創(chuàng)性檢查且價格昂貴�；诩S便的無創(chuàng)性檢查方法是更易于被接受的GIC篩查和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測的手段。越來越多的研究者致力于研究糞便中腫瘤標(biāo)記物在GIC診斷中的應(yīng)用。與易于降解的mRNA和蛋白相比,DNA甲基化更為穩(wěn)定,是更為可靠的疾病檢測標(biāo)記物。DNA甲基化(DNA methylation)是人類基因表觀遺傳學(xué)(epigenetics)的主要修飾方式之一,以往的很多研究揭示了多種基因如CDH1、P16、hMLH1、MGMT、 RASSF2等異常甲基化與GC和CRC的關(guān)系。同時,也有研究報道在CRC患者血清和糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了多種基因啟動子區(qū)域DNA的異常甲基化,例如SEPT9、 RASSF2、SFRP2等,都有可能做為CRC患者無創(chuàng)性診斷的分子標(biāo)記物。多項研究表明,在包括GIC在內(nèi)的90%以上的人類惡性腫瘤細(xì)胞中,存在hTERT mRNA的過表達(dá)和端粒酶的異�；罨�。作為端粒酶的催化亞基,hTERT的表達(dá)水平在很大程度上決定了端粒酶的活性。hTERT啟動子富含CpG二核苷酸,即存在CpG島(CpG islands)。研究發(fā)現(xiàn),hTERT啟動子在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間呈現(xiàn)出不同的甲基化狀態(tài),這使得hTERT啟動子DNA甲基化可能作為一種潛在的分子標(biāo)記物用于疾病檢測。已有研究報道,GC和CRC腫瘤組織中的hTERT啟動子DNA甲基化水平高于癌旁正常組織,且甲基化水平與hTERT mRNA的表達(dá)水平密切相關(guān)。但尚未有研究報道糞便中hTERT啟動子DNA甲基化的情況。目的闡明GIC患者腫瘤組織和糞便中hTERT啟動子DNA甲基化的水平,探討糞便中hTERT啟動子DNA甲基化水平是否可以作為GIC診斷和監(jiān)測的指標(biāo)。方法本研究收集了34例GC和CRC患者的腫瘤組織和癌旁正常組織標(biāo)本,69例GC和CRC患者的糞便標(biāo)本,以及62例非腫瘤患者的糞便標(biāo)本。腫瘤患者的糞便標(biāo)本均在接受治療前獲取,并即刻于-80℃C凍存。分別提取組織和糞便中的基因組DNA,然后進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化(bisulfite conversion)并純化,采用焦磷酸測序(pyrosequencing)技術(shù)定量檢測組織和糞便中hTERT啟動子2個CpG位點的甲基化水平。統(tǒng)計分析GC和CRC患者糞便中CpG位點甲基化水平與患者年齡、性別、腫瘤分化、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤侵襲性等臨床病理資料之間的相關(guān)性,分析該方法對GC和CRC診斷的敏感性和特異性。結(jié)果GIC腫瘤組織和癌旁正常組織中hTERT啟動子的2個被檢測CpG位點Site1和Site2的甲基化水平均具有顯著性差異(P=0.008和P=0.004)。GIC患者糞便中Sitel和Site2的甲基化水平顯著高于非腫瘤患者(P0.05)。將Site1和Site2的甲基化水平取平均值A(chǔ)vg,受試者工作特征曲線(ROC)分析顯示,對所有的GIC患者,Site1、Site2、Avg的曲線下面積(AUC)依次為0.769、0.777、0.799。GC和CRC患者糞便中Site1和Site2的甲基化水平?jīng)]有顯著性差異,且甲基化水平與年齡、性別無關(guān)。在CRC中,Duke C/D期患者Sitel位點的甲基化水平顯著高于Duke A/B期患者(P0.05)。而在GC中,組織學(xué)低分化和臨床晚期腫瘤患者Site2位點的甲基化水平更高(P0.05)。GC患者糞便潛血試驗(OBT)的AUC為0.537,CRC患者糞便OBT的AUC為0.834。將糞便hTERT啟動子的甲基化水平與OBT綜合起來進行多參數(shù)回歸ROC分析,GC和CRC的AUC可分別達(dá)到0.806和0.920。結(jié)論在所檢測的2個hTERT啟動子區(qū)域的CpG位點Site1和Site2中,GIC腫瘤組織的甲基化水平明顯高于癌旁正常組織,GIC患者糞便中hTERT啟動子DNA甲基化水平明顯高于非腫瘤患者。GIC患者糞便hTERT啟動子特定位點的甲基化水平與腫瘤的分化程度、臨床分期、以及侵襲性有關(guān)。糞便hTERT啟動子的甲基化水平與OBT綜合分析可以提高CRC患者診斷的敏感性和特異性。第二部分hTERT啟動子突變在腎細(xì)胞癌中的研究背景腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，，RCC)是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,RCC包括不同類型的腫瘤,主要有透明細(xì)胞癌(clear cell RCC,ccRCC),腎乳頭狀癌(papillary RCC,pRCC)和腎嫌色細(xì)胞癌(chromophobe RCC,chRCC)。在RCC中,端粒酶活性異常升高,但是端粒酶活化的機制尚不明確。近來研究者在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了hTERT啟動子有2個高頻突變：C228T和C250T,突變產(chǎn)成了新的ETS1結(jié)合序列,從而顯著提高了hTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性以及hTERT mRNA的表達(dá)水平,并將端粒酶活性提高了2-4倍。因此,這種突變可能是造成hTERT表達(dá)和端粒酶活性在腫瘤中異常升高的原因之一。另外,hTERT啟動子突變也和患者的臨床病理特征或疾病的預(yù)后有關(guān)。研究顯示,在黑色素瘤中,hTERT啟動子突變與患者年齡、腫瘤的厚度、是否形成潰瘍以及患者的預(yù)后等有關(guān)。在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中,hTERT啟動子突變在膀胱癌組織中的發(fā)生率較高,并且被認(rèn)為是膀胱癌中目前已知的發(fā)生頻率最高的基因改變。關(guān)于hTERT啟動子突變是否存在于RCC中,現(xiàn)有的研究還不能明確這一點,并且也不清楚突變是否與患者的臨床病理特征有關(guān)。目的分析RCC患者腫瘤組織中hTERT啟動子突變的情況,明確以上突變與患者臨床病理特征的關(guān)系,為進一步明確端粒酶異�；罨臋C制提供理論依據(jù)。方法本研究收集了109例RCC患者的腫瘤組織和癌旁正常組織,提取組織的DNA,然后采用Sanger測序法,分別檢測hTERT啟動子上C228T突變、C250T突變以及VHL基因改變的發(fā)生情況。提取腫瘤組織的RNA,采用定量Real-timePCR技術(shù)檢測hTERT mRNA的表達(dá)水平。統(tǒng)計分析腫瘤組織中hTERT啟動子突變的發(fā)生與患者年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤侵襲性以及VHL基因改變之間的相關(guān)性。結(jié)果在被檢測的109例RCC腫瘤組織中,有10例存在hTERT啟動子突變,其中9例是C228T突變,1例是C250T突變。在hTERT啟動子突變陽性和突變陰性的腫瘤組織中,hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯不同,突變陽性的ccRCC中hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯升高。在96例ccRCC中,9例突變陽性的患者中處于臨床Ⅲ/ⅣV期的有5例(5/9,55.6%),87例突變陰性的患者中處于臨床Ⅲ/Ⅳ期的有9例(9/87,10.3%),呈現(xiàn)顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.003)。hTERT啟動子突變的發(fā)生率在患者年齡、性別、腫瘤大小等方面沒有明顯的組間差異。在9例檢測出hTERT啟動子突變的ccRCC患者中,有2例發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,3例發(fā)生了腎被膜侵襲,而在未檢測出突變的87例ccRCC患者中,4例發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,3例發(fā)生了腎被膜侵襲。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腎被膜侵襲的發(fā)生率在突變陽性組和突變陰性組分別是5/9(55.6%)和7/87(8.0%)(P=0.001)。在所檢測的77例ccRCC腫瘤組織VHL基因位點中,32例(41.6%)存在VHL位點的一個或多個改變,而在這些改變中,4例發(fā)生在hTERT啟動子突變陽性的患者中,28例發(fā)生在hTERT啟動子突變陰性的患者中,其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論RCC腫瘤組織中存在著hTERT啟動子突變。ccRCC中瘤組織中hTERT啟動子突變與hTERT mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),突變陽性組和突變陰性組在腫瘤的臨床分期以及腫瘤的侵襲性方面存在明顯差異,但是在患者的年齡、性別、腫瘤大小等方面無明顯差異。ccRCC腫瘤組織中hTERT啟動子突變陽性組和突變陰性組在VHL基因改變方面無統(tǒng)計學(xué)差異。第三部分精漿刺激宮頸癌端粒酶活化過程中hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究背景宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,宮頸癌的發(fā)生與多種因素有關(guān),如人乳頭瘤病毒(HPV)感染、頻繁的性生活等,但其確切原因和發(fā)生機制尚不明確。研究證實,宮頸癌中hTERT的表達(dá)和端粒酶活性都異常升高。在宮頸組織由宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)向?qū)m頸癌惡性轉(zhuǎn)化的過程中端粒酶激活是非常重要的步驟,但是端粒酶活化的機制尚不明確。研究表明,hTERT的轉(zhuǎn)錄激活是端粒酶活化的關(guān)鍵步驟,但是目前hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制仍然不明確。hTERT轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控有很多因子的參與,包括轉(zhuǎn)錄活化因子和抑制因子。c-MYC、Sp1、雌激素等被證實是hTERT轉(zhuǎn)錄活化因子,能上調(diào)hTERT的表達(dá)；P53、轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(AP-1)、Mad等被認(rèn)為是抑制因子,抑制hTERT啟動子的活性。精漿是精液的主要組成成分之一,含有前列腺素、雌激素、孕激素、血管生長因子、細(xì)胞因子、蛋白酶、蛋白激酶等多種物質(zhì)。以往研究發(fā)現(xiàn),精漿可以促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。精漿或前列腺素E2(PGE2)處理宮頸癌細(xì)胞系后,可以誘導(dǎo)PGE2受體EP1、EP4、表皮生長因子受體(EGFR)等表達(dá)上調(diào),進而刺激腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另有研究顯示,精漿中的物質(zhì)還可以刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中白介素1-β(IL1-β).白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)等多種細(xì)胞因子或酶的表達(dá),進而影響子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的功能。目的探討在精漿刺激宮頸細(xì)胞惡變的過程中,hTERT的作用及hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。方法(1)hTERT mRNA表達(dá)水平檢測：三株宮頸癌細(xì)胞系HeLa Caski、SiHa,以及從人正常宮頸組織中分離出原代的宮頸上皮細(xì)胞,培養(yǎng)至對數(shù)生長期后經(jīng)血清饑餓處理48h,實驗組分別加入不同量的精漿,對照組均不加入精漿,24h后收獲細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA后采用定量Real-time PCR技術(shù)檢測hTERT mRNA的表達(dá)水平。(2)端粒酶活性檢測：經(jīng)培養(yǎng)和處理的三株細(xì)胞系和宮頸上皮細(xì)胞(方法同上),收獲細(xì)胞后采用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA試劑盒定量檢測端粒酶活性。(3)Western Blotting:檢測COX-2、Spl的蛋白表達(dá)水平。(4)hTERT啟動子活性測定：采用hTERT啟動子活性報告質(zhì)粒和Progema熒光素酶活性雙報告系統(tǒng)進行檢測。(5)siRNA技術(shù)：采用COX-2特異性siRNA,抑制HeLa細(xì)胞中COX-2的表達(dá)。(6)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)：實驗組HeLa細(xì)胞(加入PGE2或精漿)和對照組HeLa細(xì)胞(不加入PGE2或精漿),甲醛溶液使組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子與DNA交聯(lián)。收獲細(xì)胞后將DNA超聲碎裂成200-1 000bp的片段。用Spl抗體或乙�；慕M蛋白H3、H4抗體沉淀相應(yīng)的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,用蛋白A/G瓊脂糖收集,然后洗脫、去交聯(lián)。最后獲取DNA,進行定量PCR擴增。(7)動物實驗：雌性BALB/c裸鼠12只(出生6周)。血清饑餓的HeLa細(xì)胞,實驗組加入精漿,對照組不加入精漿。懸浮后注射入裸鼠腋窩部皮下,3周后取出腫瘤組織分析。結(jié)果(1)在三株細(xì)胞系HeLa、Caski、SiHa中,實驗組(精漿處理組)的hTERT mRNA的表達(dá)水平均明顯高于對照組(P0.01),實驗組HeLa和Caski中端粒酶活性也明顯升高(P0.05和P0.01)。而在原代培養(yǎng)的正常宮頸上皮細(xì)胞中,對照組hTERT mRNA表達(dá)量很低或無法檢出,但實驗組加入精漿(終濃度為1：10)時,hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P0.05),端粒酶活性也明顯升高(P0.05)。(2)選用特異性COX-2 siRNA抑制HeLa細(xì)胞中COX-2的表達(dá)后,實驗組(精漿處理組)的hTERT mRNA表達(dá)未見明顯異常,而用非特異性siRNA處理HeLa細(xì)胞后,實驗組hTERT mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組。(3)采用hTERT熒光素酶報告載體p181晰轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,實驗組HeLa細(xì)胞hTERT啟動子活性明顯高于對照組(P0.05)。然后用COX-2特異性siRNA抑制COX-2表達(dá)后,實驗組hTERT啟動子活性與對照組相比,其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。(4)采用Western Blotting的方法,實驗組HeLa細(xì)胞分別加入精漿和PGE2,24小時后收集細(xì)胞進行檢測,發(fā)現(xiàn)精漿處理組和PGE2處理組Spl蛋白的表達(dá)水平均明顯升高,分別是之前的5.6倍和6.5倍。(5)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗發(fā)現(xiàn),HeLa細(xì)胞加入精漿或PGE2處理后,Spl抗體沉淀的DNA中hTERT啟動子片段被明顯募集,還同時伴有乙�；慕M蛋白H3和H4的增加。(6)動物實驗結(jié)果顯示,裸鼠體內(nèi)精漿處理過的HeLa細(xì)胞所生長出的腫瘤組織比對照組HeLa細(xì)胞所生長出的腫瘤組織體積明顯增大、重量明顯增加。結(jié)論精漿能促進宮頸癌細(xì)胞系和原代培養(yǎng)的正常宮頸上皮細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)水平及端粒酶活性上調(diào)。精漿誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中hTERT啟動子活性升高,同時伴有Spl表達(dá)增加以及Spl與hTERT啟動子結(jié)合的增強。COX-2介導(dǎo)了精漿促進hTERT轉(zhuǎn)錄激活和端粒酶活性上調(diào)的過程,即這一過程是通過COX-2-PGE2-Sp1軸實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730


本文編號：2416160