【摘要】：背景:結(jié)腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和致死率逐年上升,正嚴(yán)重的威脅著人類的健康。結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的研究有助于發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后預(yù)測標(biāo)志和治療靶點。近些年許多研究表明,miRNA的改變對于結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此,miRNA是結(jié)腸癌早期診斷和治療及患者預(yù)后預(yù)測的潛在標(biāo)志物,更有可能成為結(jié)腸癌分子靶向治療的潛在靶點。目的:通過臨床病例研究探討miR-544與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其作為分子標(biāo)志物預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后的臨床價值。通過細胞學(xué)實驗證實miR-544在結(jié)腸癌中的功能作用,并試闡明miR-544調(diào)控結(jié)腸癌細胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機制。方法:1.采用RT-qPCR方法檢測20例配對的結(jié)腸癌旁正常組織以及85例結(jié)腸癌組織中miR-544表達水平,采用配對t檢驗比較miR-544在癌組織及正常組織中的表達水平的差異,卡方檢驗比較結(jié)腸癌患者原發(fā)組織中miR-544的表達水平與結(jié)腸癌患者臨床病理因素的關(guān)系,Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)腸癌患者組織中miR-544的表達水平與結(jié)腸癌患者總生存(overall Survival,OS)的關(guān)系,Cox比例風(fēng)險回歸模型評價miR-544作為預(yù)后預(yù)測分子標(biāo)志物的臨床價值;2.采用RT-q PCR方法檢測不同結(jié)腸癌細胞系中miR-544的表達水平,分選擇出miR-544高表達和低表達的結(jié)腸癌細胞系;3.轉(zhuǎn)染miR-544 mimics和miR-544 inhibitor分別使結(jié)腸癌細胞過表達miR-544和沉默內(nèi)源性miR-544表達,通過MTT和克隆形成實驗觀察miR-544對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響,通過Transwell實驗觀察miR-544對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響;4.通過流式細胞術(shù)檢測miR-544表達對結(jié)腸癌細胞細胞周期分布的影響,通過Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白pRb和Cyclin D1表達水平;5.通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-544下游調(diào)控的靶基因,通過和雙熒光酶報告系統(tǒng)結(jié)合定點突變技術(shù)分析miR-544對下游潛在靶基因FOXO1的調(diào)節(jié)活性,通過RT-q PCR和Western blot檢測miR-544對FOXO1表達水平的影響。結(jié)果:1.miR-544在結(jié)腸癌組織中的表達高于配對癌旁正常組織(P0.001);miR-544高表達率在高/中分化的組織學(xué)分級較低分化組顯著降低(P=0.047),且在淋巴結(jié)呈陽性的結(jié)腸癌患者組中顯著高于淋巴結(jié)呈陰性的結(jié)腸癌患者組(P=0.005);miR-544高表達的結(jié)腸癌患者較低表達患者預(yù)后差(P=0.018),但miR-544表達水平不是預(yù)測結(jié)腸癌患者OS的獨立預(yù)測因素(P=0.117);2.miR-544在結(jié)腸癌細胞HCT116中高表達,在結(jié)腸癌細胞HT29中低表達;3.在HT29細胞中過表達miR-544能促進結(jié)腸癌細胞的增殖和侵襲能力,在HCT116細胞中沉默miR-544表達能抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和侵襲能力;4.在HT29結(jié)腸癌細胞中過表達miR-544能促進細胞周期G1至S期轉(zhuǎn)換,伴隨pRb和Cyclin D1表達上調(diào),在HCT116結(jié)腸癌細胞中降表達miR-544能導(dǎo)致細胞周期G1期阻滯,伴隨pRb和Cyclin D1表達下調(diào);5.通過序列比對預(yù)測miR-544下游調(diào)控的靶基因,結(jié)果顯示FOXO1 3’-UTR區(qū)含有miR-544潛在的結(jié)合位點;雙熒光報告系統(tǒng)證明miR-544能降低FOXO1 3’-UTR的活性;進一步結(jié)合位點突變技術(shù)發(fā)現(xiàn),miR-544不能降低miR-544結(jié)合位點突變的FOXO1 3’-UTR活性,在HT29結(jié)腸癌細胞中過表達miR-544能降低FOXO1 m RNA和蛋白的表達水平,在HCT116結(jié)腸癌細胞中降表達miR-544能上調(diào)FOXO1 m RNA和蛋白的表達水平。6.在HT29結(jié)腸癌細胞中過表達miR-544使mTOR、PI3K和AKT的磷酸化水平提高,而同時外源過表達FOXO1能下調(diào)mTOR、PI3K和AKT的磷酸化水。結(jié)論:1.miR-544高表達是結(jié)腸癌患者早發(fā)轉(zhuǎn)移和分化差的分子標(biāo)志,且可預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后;2.miR-544通過抑制FOXO1表達促進結(jié)腸癌細胞增殖和侵襲能力;3.miR-544通過調(diào)控FOXO1表達促進結(jié)腸癌細胞細胞周期進程。4.miR-544通過調(diào)控FOXO1表達,影響PI3K/AKT信號通路促進結(jié)腸癌進展
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

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本文編號：2410563