【摘要】：研究背景：多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是一種漿細(xì)胞系統(tǒng)惡性克隆性疾病,主要特征為漿細(xì)胞克隆性增值并導(dǎo)致血和尿中出現(xiàn)大量免疫球蛋白M蛋白。目前治療主要根據(jù)患者的危險(xiǎn)度分層進(jìn)行個(gè)體化治療,雖然新藥如免疫調(diào)節(jié)劑及蛋白酶體抑制劑的使用延長(zhǎng)了患者的生存期,但大部分患者最終疾病會(huì)復(fù)發(fā),因而就需要更新的治療藥物及方法。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors,CARs)修飾的淋巴細(xì)胞治療惡性腫瘤是一種新的免疫治療方法。前期研究發(fā)現(xiàn)嵌合抗原受體修飾的NK細(xì)胞具有抗骨髓瘤效應(yīng),為臨床使用該項(xiàng)技術(shù)提供了理論依據(jù)。研究目的：該研究主要探討嵌合抗原受體設(shè)計(jì)的NK細(xì)胞的抗骨髓瘤效應(yīng)研究方法：本研究首先提取Jurkat細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過PCR的方法合成CD28片段和CD3ζ片段,紫外光下切膠回收片段,通過雙酶切連接的方法使每個(gè)片段連接到pcDNA3.1質(zhì)粒,抗CD138scFv片段由我院生物治療科提供片段由基因公司合成并連接到pcDNA3.1質(zhì)粒,DNA測(cè)序正確后繼續(xù)雙酶切連接的方法使三個(gè)片段首尾彼此相連成融合片段,測(cè)序正確后,雙酶切片段回收連接到pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro質(zhì)粒，通過三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)(pSPAX2, pMD2G,pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集病毒并測(cè)定病毒滴度,接著使用病毒感染NK92MI細(xì)胞系,并通過嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞株,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后，，通過PCR及Western Blot驗(yàn)證CAR(抗CD138-CD28-CD3ζ)在NK92MI細(xì)胞系的表達(dá),驗(yàn)證正確后進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。在細(xì)胞試驗(yàn)中,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK92MI細(xì)胞分泌細(xì)胞因子cd107a的能力,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。從而在細(xì)胞水平驗(yàn)證CAR-NK細(xì)胞的抗骨髓瘤作用。研究結(jié)果①通過基因工程技術(shù),體外構(gòu)建CAR基因片段,通過基因測(cè)序驗(yàn)證基因序列正確。②經(jīng)過病毒包裝技術(shù),獲得表達(dá)該片段的病毒株。③經(jīng)過病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),獲得表達(dá)CAR融合蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)NK細(xì)胞株。④經(jīng)PCR及Western Blot證實(shí)CAR融合蛋白在NK細(xì)胞表達(dá)。⑤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)CAR NK細(xì)胞具有明顯的殺傷多發(fā)性骨髓瘤的效應(yīng)，CARNK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子cd107a的能力明顯優(yōu)于對(duì)照組。研究結(jié)論：①CAR(抗CD138-CD28-CD3ζ)能在體外構(gòu)建并在NK92細(xì)胞表面表達(dá)②CAR NK細(xì)胞能殺傷表達(dá)cd138抗原的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株,從而發(fā)揮抗骨髓瘤效應(yīng)。
[Abstract]:Background: multiple myeloma (Multiple Myeloma, MM) is a malignant clonal disease of plasmacyte system, which is characterized by cytoplasmic clonality increment and a large number of immunoglobulin M proteins in blood and urine. Although the use of new drugs, such as immunomodulators and proteasome inhibitors, prolongs the patient's survival, most patients will eventually recur. Therefore, the need for newer treatment drugs and methods. Lymphocyte modified by chimeric antigen receptor (chimeric antigen receptors,CARs) is a new immunotherapy method for malignant tumor. Previous studies have found that NK cells modified by chimeric antigen receptors have anti-myeloma effect, which provides a theoretical basis for clinical use of this technique. Objective: to investigate the anti-myeloma effect of NK cells designed by chimeric antigen receptor. In this study, the total RNA, reverse transcription synthesis (cDNA,) of Jurkat cells was first extracted. CD28 fragments and CD3 味 fragments were synthesized by PCR. Each fragment was ligated to pcDNA3.1 plasmid by double enzyme ligation. The CD138scFv fragment was synthesized by gene company and ligated to pcDNA3.1 plasmid by the biotherapeutic department of our hospital. After correct sequencing, the DNA sequence was sequenced correctly and the three fragments were linked to each other to form fusion fragments. After correct sequencing, the fragments were recovered and ligated to the pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro plasmid, and the three plasmid lentivirus packaging system (pSPAX2,) was used. PMD2G,pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro) was transfected into 293T cells, virus titer was collected and virus titer was measured, then virus was used to infect NK92MI cell line, then positive cell line was screened by purine mycin, and stable transfection cell line was established. The expression of CAR (anti CD138-CD28-CD3 味) in NK92MI cell line was confirmed by PCR and Western Blot. Flow cytometry was used to detect the ability of NK92MI cells to secrete cytokine cd107a. In order to verify the anti-myeloma effect of CAR-NK cells at the cell level. Results 1 the CAR gene fragment was constructed in vitro by genetic engineering technique, and the gene sequence was verified by gene sequencing. 2 the virus strain expressing the fragment was obtained by virus packaging technology. A stable NK cell line expressing CAR fusion protein was obtained. 4 the expression of CAR fusion protein in NK cells was confirmed by PCR and Western Blot. 5 cell killing experiments showed that CAR NK cells had obvious killing effect on multiple myeloma. The ability of CARNK cells to secrete cytokine cd107a was significantly better than that of control group. Conclusion: 1CAR (anti CD138-CD28-CD3 味) can construct in vitro and express 2CAR NK cells on the surface of NK92 cells, which can kill multiple myeloma cell lines expressing cd138 antigen, thus exerting anti-myeloma effect.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 丁亞文,邱玉健,周家善;多發(fā)性骨髓瘤誤診1例[J];山東醫(yī)藥;2000年23期

2 陳燕,王燕婷,歐陽(yáng)仁榮;未分泌型多發(fā)性骨髓瘤二例[J];上海醫(yī)學(xué);2000年02期

3 賈有榮,方忠梅,劉偉;刻舟求劍顧舊病 景過時(shí)遷漏新疾──1例多發(fā)性骨髓瘤誤診的經(jīng)過[J];新醫(yī)學(xué);2000年03期

4 王煒琴,盧興國(guó),朱彪;多發(fā)性骨髓瘤患者的丙型肝炎病毒感染[J];中華血液學(xué)雜志;2000年05期

5 侯健;加強(qiáng)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的研究[J];中華血液學(xué)雜志;2000年11期

6 余潤(rùn)泉;多發(fā)性骨髓瘤治療進(jìn)展[J];中華血液學(xué)雜志;2000年11期

7 劉以淑,肖文義;12例多發(fā)性骨髓瘤誤診分析[J];重慶醫(yī)學(xué);2000年02期

8 何建明;以癲癇首發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤一例報(bào)告[J];華夏醫(yī)學(xué);2000年01期

9 潘海波;多發(fā)性骨髓瘤非典型表現(xiàn)誤診19例分析[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2000年05期

10 孫可;多發(fā)性骨髓瘤誤診分析(附13例報(bào)告)[J];廣西醫(yī)學(xué);2000年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李利紅;冷蕓;劉晉瑋;陳文明;;多發(fā)性骨髓瘤高凝機(jī)制的研究[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

2 汪萍;沈立松;;B淋巴細(xì)胞刺激物與多發(fā)性骨髓瘤[A];全國(guó)臨床免疫檢驗(yàn)研討會(huì)暨第六屆全國(guó)臨床免疫學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 陳文明;;多發(fā)性骨髓瘤的診斷與治療[A];全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

4 郭宇;;多發(fā)性骨髓瘤15例延誤診斷原因分析[A];第十一屆山西省血液病學(xué)術(shù)年會(huì)暨國(guó)家級(jí)及山西省繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2010年

5 陸海波;白玉賢;吳瑾;周建華;;25例多發(fā)性骨髓瘤的診治分析[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

6 孫延霞;張鳳春;盧振霞;孫步彤;林玉梅;;白介素6在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)與臨床[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

7 陳文明;翟玉華;張鵬;宿麗;;多發(fā)性骨髓瘤白介素-6和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的檢測(cè)及意義[A];第九屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

8 陳文明;翟玉華;張鵬;宿麗;;多發(fā)性骨髓瘤白介素-6和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的檢測(cè)及意義[A];第三屆全國(guó)血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

9 鄭立;;59例多發(fā)性骨髓瘤的臨床分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

10 ;多發(fā)性骨髓瘤和并發(fā)癥處理[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 李穎;我國(guó)發(fā)布首個(gè)多發(fā)性骨髓瘤診治指南[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

2 王建新;對(duì)多發(fā)性骨髓瘤治療要有信心[N];中國(guó)消費(fèi)者報(bào);2008年

3 河南省腫瘤研究所 程心超;識(shí)別多發(fā)性骨髓瘤[N];健康報(bào);2010年

4 天津市腫瘤醫(yī)院血液科主任 張翼澾　李運(yùn)紅 胡顏 整理;多發(fā)性骨髓瘤 發(fā)病靜悄悄[N];健康報(bào);2011年

5 北京朝陽(yáng)醫(yī)院京西院區(qū)血液與腫瘤科主任醫(yī)師 黃仲夏;多發(fā)性骨髓瘤易誤診[N];健康報(bào);2013年

6 馬飛;抗多發(fā)性骨髓瘤新藥研發(fā)踏上新征途[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2013年

7 記者 馮衛(wèi)東;多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)機(jī)理揭開[N];科技日?qǐng)?bào);2013年

8 陳文明邋馮靜;多發(fā)性骨髓瘤 把握治療時(shí)機(jī)[N];健康報(bào);2007年

9 李穎;萬(wàn)珂為多發(fā)性骨髓瘤帶來希望[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

10 徐述湘;多發(fā)性骨髓瘤治療進(jìn)入新階段[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 鄧書會(huì);多發(fā)性骨髓瘤伴髓外病變臨床研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

2 王棟;PAX5通過結(jié)合RIP2調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

3 劉增艷;miR-186抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2016年

4 于曉晨;多發(fā)性骨髓瘤髓外病變患者M(jìn)YC激活的預(yù)后意義及其分子機(jī)制探討[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

5 范宇;ZNF545在多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌和食管癌中的表觀調(diào)控及其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

6 魏華萍;嵌合抗原受體修飾的NK細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2016年

7 韓曉雁;多發(fā)性骨髓瘤化療相關(guān)性周圍神經(jīng)病變的防治策略及其相關(guān)細(xì)胞因子的研究[D];浙江大學(xué);2016年

8 吳洪坤;miR-145-3p靶向HDAC4調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡與自噬的作用及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

9 楊龍江;血小板因子4及其17-70肽段在多發(fā)性骨髓瘤中的作用及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

10 王雅丹;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在多發(fā)性骨髓瘤血管新生中的作用及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張艷花;天然小分子化合物CADPE和ZZZ-1體外抗多發(fā)性骨髓瘤作用及潛在機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 楊志瑞;去甲基化藥物聯(lián)合DLI治療多發(fā)性骨髓瘤的免疫效應(yīng)和機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

3 余慶峰;神經(jīng)鈣粘素在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義[D];鄭州大學(xué);2015年

4 程瑩;淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在初診多發(fā)性骨髓瘤中的臨床意義[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王蕾;泊馬度胺聯(lián)合CAR-T細(xì)胞抗多發(fā)性骨髓瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2015年

6 蘆晗;三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤檢測(cè)中的應(yīng)用[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

7 王芝濤;髓系來源抑制性細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤患者中表達(dá)及臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

8 葛雪蘋;粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合BCD方案誘導(dǎo)治療初治非多發(fā)性骨髓瘤的療效及安全性評(píng)估[D];蘇州大學(xué);2015年

9 張玉皎;硼替佐米聯(lián)合地西他濱對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2015年

10 陳丹;桔梗皂苷D抑制人多發(fā)性骨髓瘤（RPMI8226）增殖及其機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2408831