【摘要】：肝癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其中70%-90%為肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。全世界范圍內(nèi)年肝癌死亡人數(shù)約為74.5萬,占癌癥致死率的第三位。其中我國的新增病例和死亡病例均占全球的一半。肝癌臨床治療失敗及死亡率高的主要原因是大部分病例初次診斷即有轉(zhuǎn)移,據(jù)統(tǒng)計80%以上的患者最終死于肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移。但對肝癌轉(zhuǎn)移的生物學機制未完全闡明,仍未有轉(zhuǎn)移及預后相關(guān)的臨床檢測生物標志物,所以發(fā)掘肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白具有重要意義。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一項動態(tài)復雜的過程,受環(huán)境影響及多種信號分子的調(diào)控。惡性腫瘤是一種多基因病同時也是一種蛋白質(zhì)組疾病,因為基因功能的實現(xiàn)要靠生物學功能的執(zhí)行者蛋白分子。所以本研究通過以同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D-LC-MS/MS)的高通量的蛋白組學對不同轉(zhuǎn)移潛能細胞株的蛋白組學研究,篩選并鑒定出與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白,為后續(xù)肝癌轉(zhuǎn)移的預警和干預研究提供新的靶標。我們研究選擇三株具有相同遺傳背景不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3作為分析研究材料,源于同一名肝癌病人的新鮮瘤組織分離,并進一步通過裸鼠體內(nèi)肝臟原位移植和體外分篩的方法建立。經(jīng)過收集胞質(zhì)蛋白,脫鹽、濃縮、酶解并用iTRAQ技術(shù)對其進行標記,應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對肽段進行檢測分析,以實現(xiàn)對差異蛋白的分離和鑒定。得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進行比對,對蛋白進行注釋。應(yīng)用生物信息學軟件對差異表達的蛋白進行GO(Gene ontology)功能分析和通路分析以篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)的目標蛋白。并用RT-PCR和Western blot對其中部分差異蛋白進行驗證。免疫組化分析檢測從差異表達蛋白中優(yōu)先選出的目標蛋白PLEC并對其表達與肝癌臨床病理特征及預后關(guān)系進行統(tǒng)計學分析。經(jīng)過iTRAQ標記并質(zhì)譜檢測分析,共發(fā)現(xiàn)鑒定到1170個蛋白,其中在L/H(MHCC97-L/MHCC9-H)組鑒定發(fā)現(xiàn)47個差異表達蛋白,在M/H(HCCLM3/MHCC97-H)組鑒定發(fā)現(xiàn)65個差異表達蛋白。生物信息學分析提示L/H和M/H組差異表達的蛋白主要參與酶的催化和細胞間的粘附,并且參與細胞代謝的過程。應(yīng)用RT-PCR對差異較大的蛋白進行了轉(zhuǎn)錄水平的驗證,符合質(zhì)譜結(jié)果。應(yīng)用Western blot在蛋白水平上的驗證,PLEC在高轉(zhuǎn)移細胞株MHCC97-H和HCCLM3中表達上調(diào),SHMT2在HCCLM3中的表達上調(diào),LDHA在HCCLM97-H中表達上調(diào)。在免疫組化染色進一步證實:PLEC在胞膜中的表達在癌組織中較癌旁組織高,PLEC在胞膜中的表達量與TNM分期及腫瘤大小呈正相關(guān)相關(guān)(P=0.019,P=0.044);且Kaplan-Meier生存曲線分析顯示PLEC胞膜中高表達的患者的生存率低(P=0.016);Cox回歸分析證明PLEC在胞膜中的表達升高是肝癌預后的獨立危險因素,提示PLEC在細胞膜中高表達與肝癌的轉(zhuǎn)移及預后可能相關(guān)。在本研究中應(yīng)用iTRAQ標記高通量的蛋白質(zhì)組學技術(shù)對三株不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞系的差異表達蛋白進行檢測和鑒定分析,并經(jīng)過對肝癌病人組織的免疫組化分析首次發(fā)現(xiàn)PLEC蛋白是一種新的與肝癌轉(zhuǎn)移及預后可能相關(guān)的蛋白。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2406156