【摘要】：蛋白質的分泌是一個重要的生理學活動。蛋白質的分泌途徑分為經(jīng)典分泌途徑(內質網(wǎng)-高爾基體途徑)和非經(jīng)典分泌途徑。目前,蛋白質分泌的研究成果并不顯著,已知的分泌蛋白非常有限,且它們的分泌途徑和分子機制也還不明確。隨著研究的深入,已發(fā)現(xiàn)有些分泌蛋白并不屬于既定的經(jīng)典分泌蛋白或非經(jīng)典分泌蛋白,這些發(fā)現(xiàn)將對蛋白分泌的研究具有重要意義。Ⅱ型c GMP依賴性蛋白激酶(Type Ⅱ c GMP-dependent protein kinase,PKG Ⅱ)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其在腫瘤組織和腫瘤細胞株的表達和活性很低,研究發(fā)現(xiàn)它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關系。本研究利用Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)PKG Ⅱ存在于腺病毒Ad-PKG Ⅱ感染的胃癌細胞株HGC-27和宮頸癌細胞株Hela的上清中;利用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)PKG Ⅱ也存在于人和小鼠血清中。上述結果明確了PKG Ⅱ是分泌蛋白。本課題接著深入研究PKG Ⅱ的分泌途徑。利用軟件Signal P 4.1 Server分析PKG Ⅱ的氨基酸序列,結果發(fā)現(xiàn)PKG Ⅱ并無經(jīng)典信號肽序列,提示PKG Ⅱ應該屬于非經(jīng)典分泌蛋白。采用激光共聚焦觀察到PKG Ⅱ與HGC-27細胞溶酶體標記物溶酶體相關膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)不發(fā)生共定位,且發(fā)現(xiàn)PKG Ⅱ并不存在于外泌體中,這說明PKG Ⅱ并不通過這兩種非經(jīng)典分泌途徑—溶酶體途徑和外泌體途徑分泌。鑒于PKG Ⅱ在細胞內的分布與內質網(wǎng)和高爾基體分布相似,于是利用激光共聚焦觀察到HGC-27細胞與人小腸中PKG Ⅱ與內質網(wǎng)標記蛋白葡萄糖6磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-Pase)/高爾基體標記蛋白順式高爾基體基質蛋白(130 k Da cis Golgi matrix protein,GM130)都有共定位。為進一步證明PKG Ⅱ是經(jīng)過內質網(wǎng)-高爾基體途徑,進行了如下實驗:利用特異性阻斷內質網(wǎng)-高爾基體途徑的抑制劑布雷菲爾德菌素(brefeldin A,BFA)來進行體內和體外實驗,通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)BFA能夠阻斷細胞內和小鼠體內PKG Ⅱ的分泌;利用免疫共沉淀法檢測到PKG Ⅱ與內質網(wǎng)腔蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78(78 k Da glucose-regulated protein,GRP78)是相互結合的;采用肽N-糖苷酶F酶解法發(fā)現(xiàn)酶切組的PKG Ⅱ的分子量有所減小,表明細胞內的PKG Ⅱ經(jīng)歷N-糖基化修飾;提取細胞中的高爾基體檢測發(fā)現(xiàn)PKG Ⅱ存在于高爾基體內。上述結果證明了PKG Ⅱ是經(jīng)過經(jīng)典途徑分泌。本課題進一步探討了PKG Ⅱ進入內質網(wǎng)的機制。鑒于PKG Ⅱ是豆蔻酰化蛋白,將PKG Ⅱ N端的甘氨酸突變成不能被豆蔻酰修飾的丙氨酸,發(fā)現(xiàn)2位甘氨酸的突變就能改變PKG Ⅱ在細胞內的分布;構建腺病毒Ad-PKG Ⅱ-G2A,檢測培養(yǎng)上清中它的含量及與細胞內質網(wǎng)/高爾基體的共定位,結果發(fā)現(xiàn),細胞不分泌2位突變的PKG Ⅱ,且它也不與內質網(wǎng)/高爾基體共定位,即它不再經(jīng)過這條途徑分泌。以上的研究表明PKG Ⅱ的豆蔻酰修飾能影響它的分泌,而蛋白的豆蔻酰修飾由豆蔻酰轉移酶引起,于是本課題研究豆蔻酰轉移酶1(myristoyl Co A:protein N-myristoyltransferse 1,NMT-1)與PKG Ⅱ的關系。利用免疫共沉淀法檢測到PKG Ⅱ與NMT-1是相互結合的;利用激光共聚焦觀察到在HGC-27細胞內以及人胃腸標本中PKG Ⅱ與NMT-1具共定位關系。為進一步證明PKG Ⅱ的豆蔻酰修飾能影響它的分泌,再采用豆蔻酰轉移酶抑制劑Tris(dibenzylideneacetone) dipalladium(DBA)和2-Hydroxymyristic Acid(HMA)進行體內和體外實驗。體內外實驗顯示,注射抑制劑組,PKG Ⅱ在小鼠血清和HGC-27上清中的含量顯著下降,表明PKG Ⅱ的豆蔻酰修飾能影響小鼠體內和細胞中PKG Ⅱ的分泌�；趯嶒灲Y果和文獻推測,PKG Ⅱ的2位甘氨酸的豆蔻�；苡绊懞铣傻男律牡氖杷�,從而影響它與內質網(wǎng)膜結構的結合,進而影響它進入內質網(wǎng)-高爾基體分泌途徑。本課題還要明確影響PKG Ⅱ分泌的氨基酸序列。信號識別顆粒54(signal recognition particle 54,SRP54)與信號肽序列的識別是引導新生肽到內質網(wǎng)關鍵的一步。本課題采用si RNA干擾細胞中SRP54的表達,結果表明PKG Ⅱ的分泌受SRP54的影響。再檢測到PKG Ⅱ與SRP54是相互結合的,提示PKG Ⅱ確實存在一段序列供SRP54識別并結合。在保留2位甘氨酸的基礎上,對PKG Ⅱ的N端進行序列逐一敲除實驗,構建7個缺失體,結果顯示轉染PKG Ⅱ-Del3-30-flag質粒的細胞不分泌PKG Ⅱ,且PKG Ⅱ不與GM130發(fā)生共定位。再利用免疫共沉淀法檢測到缺失3-30位氨基酸的PKG Ⅱ與SRP54的結合能力大幅減弱。以上結果表明PKG Ⅱ通過3-30位氨基酸這段序列與SRP54識別并結合,進而引導其進入內質網(wǎng)-高爾基體途徑分泌。本課題最后要明確在PKG Ⅱ中發(fā)揮信號肽作用的序列。結合PKG Ⅱ的2位甘氨酸豆蔻酰修飾以及3-30位氨基酸的作用,利用免疫共沉淀檢測PKG Ⅱ-flag、PKG Ⅱ-Del3-30-flag和PKG Ⅱ-G2A-flag三種質粒表達后與SRP54的結合能力,結果顯示在轉染缺失3-30位氨基酸或者2位甘氨酸突變的質粒的細胞內,PKG Ⅱ和SRP54的結合大幅減弱,且程度相似。這表明,PKG Ⅱ的2-30位氨基酸很可能發(fā)揮信號肽序列的作用。鑒于起始氨基酸的作用,于是構建PKG Ⅱ的1-30位氨基酸的質粒和肽段去分別進行驗證,免疫沉淀結果發(fā)現(xiàn)在IP組能檢測到SRP54,表明PKG Ⅱ-N30AA能結合SRP54,且IP組的SRP54含量為PKG Ⅱ-Myr-N29AA-flag多肽組PKG Ⅱ-N30AA-flag多肽組PKG Ⅱ-N30AA-flag多肽組+HMA,這進一步表明,豆蔻�；腜KG Ⅱ-N30AA更利于它與SRP54的結合,也就是更利于它的分泌。從而確定了PKG Ⅱ 2位甘氨酸的豆蔻酰修飾以及3-30位氨基酸序列共同發(fā)揮信號肽的作用。本課題還探究了這段序列能否引導異源蛋白的分泌。結果顯示,在轉染PKG Ⅱ-N30AA-GFP質粒組,GFP的分布發(fā)生改變,且與GM130發(fā)生明顯共定位。這也驗證了PKG Ⅱ-N30AA能作為信號肽序列引導GFP進入內質網(wǎng)-高爾基體途徑分泌。本研究還從上百種豆蔻酰化蛋白中選擇了一些在細胞中表達較高的蛋白來檢測它們的分泌情況,結果發(fā)現(xiàn),瓣狀內切核酸酶1(flap endonuclease 1,FEN1)和c AMP依賴性蛋白激酶(c AMP-dependent protein kinase,PKA)屬于分泌型豆蔻�；鞍�,而肉豆蔻�；彼嶝S富蛋白激酶C底物(Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate,MARCKS)和絲氨酸/蘇氨酸PI3K調節(jié)亞基4(The serine/threonine phosphatidylinositide 3-kinase regulatory subunit 4,PIK3R4/Vps15)以及2'-5'-寡腺苷酸合成酶2(2'-5'-oligoadenylate synthetase 2,OAS2)為非分泌型豆蔻�；鞍�,其中,內皮一氧化氮合酶(nitric oxide synthase3,NOS3)為選擇性分泌蛋白。表明蛋白的分泌機制是很復雜的,豆蔻酰修飾可能只是豆蔻酰化蛋白分泌的條件之一,應該還與其氨基酸序列相關。采用si RNA干擾SRP54的表達,發(fā)現(xiàn)隨著SRP54的表達降低,細胞上清中FEN1和PKA的含量明顯減少。結果表明,FEN1和PKA的分泌受SRP54的影響。表明可以效仿PKG Ⅱ分泌機制的研究方法,深入研究FEN1和PKA,為豆蔻酰蛋白分泌的研究做鋪墊。綜上所述,PKG Ⅱ為分泌蛋白,通過2位甘氨酸的豆蔻酰修飾和3-30位氨基酸序列共同發(fā)揮信號肽作用,從而被SRP54識別并結合,進而引導其進入內質網(wǎng)-高爾基體途徑分泌。
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【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.43

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本文編號：2401120