【摘要】：研究目的膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率占消化道腫瘤的7位。由于膽囊癌細(xì)胞能較快地通過直接浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移、血運轉(zhuǎn)移等方式在早期發(fā)生廣泛擴(kuò)散,大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期,根治性手術(shù)切除率低,預(yù)后極差,中位生存期小于1年。Micro RNA(miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA分子,它們能夠通過與靶基因的m RNA分子從而起到對靶基因的調(diào)控作用。已有大量報道發(fā)現(xiàn)這種小RNA分子幾乎參與調(diào)控了細(xì)胞生命周期中所以的關(guān)鍵步驟,但在膽囊癌領(lǐng)域研究較少。方法1、通過高通量Agilent人類miRNA芯片(V.19.0)檢測膽囊癌組織及其相對應(yīng)的癌旁組織中miRNA的表達(dá)譜,選擇表達(dá)量顯著異常的miRNA作為研究對象。2、通過使用Real-Time PCR方法檢測40例膽囊癌組織及其癌旁組織中miR-29c-5p的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),miR-29c-5p在腫瘤組織中異常低表達(dá),同時發(fā)現(xiàn)miR-29c-5p與膽囊癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。3、體內(nèi)體外實驗發(fā)現(xiàn),miR-29c-5p調(diào)控膽囊癌細(xì)胞增殖及抑制其浸潤轉(zhuǎn)移的能力,這一現(xiàn)象可能是由miR-29c-5p抑制膽囊癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)所調(diào)控的。4、MiR-29c-5p的靶基因的確定:結(jié)合miRDB和miRanda等生物信息學(xué)預(yù)測與雙熒光素酶報告基因方法檢測miR-29c-5p對靶基因3‘UTR的結(jié)合作用,Western blot在蛋白水平檢測其對靶基因的抑制作用,免疫組化檢測SPOCK1基因和膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系。5、SPOCK1作為miR-29c-5p的靶基因在miR-29c-5p的生物學(xué)功能中的作用:SPOCK1在miR-29c-5p對膽囊癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用—SPOCK1過表達(dá)質(zhì)粒和miR-29c-5p共轉(zhuǎn)染后進(jìn)行Transwell實驗;Western blot驗證EMT相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果1、通過膽囊癌差異性表達(dá)檢測確定miR-29c-5p為核心的膽囊癌相關(guān)miRNA;2、體內(nèi)體外實驗證明miR-29c-5p過表達(dá)通過調(diào)控EMT抑制膽囊癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,并抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖;3、SPOCK1被證實為miR-29c-5p的靶基因;4、SPOCK1在膽囊癌中起癌基因作用,并且在miR-29c-5p的抑癌作用中起關(guān)鍵作用。結(jié)論MiR-29c-5p通過靶向SPOCK1在膽囊癌的生長和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,提示干預(yù)miR-29c-5p可能成為膽囊癌治療的重要部分。
[Abstract]:Objective gallbladder carcinoma is the most common malignant tumor in the biliary system. Because gallbladder cancer cells can spread widely in the early stage through direct infiltration, lymphatic metastasis, blood metastasis and so on, most of the patients are found to be in the middle and late stage, the rate of radical resection is low, and the prognosis is extremely poor. . Micro RNA (miRNA) with median survival of less than one year is a new class of non-coding small RNA molecules, which can regulate the target gene by interacting with the m RNA molecule of the target gene. It has been widely reported that this small RNA molecule is almost involved in the key steps of regulating cell life cycle, but less research has been done in the field of gallbladder carcinoma. Methods 1. High throughput Agilent human miRNA microarray (V.19.0) was used to detect the miRNA expression profile in gallbladder carcinoma tissues and their corresponding adjacent tissues. By using Real-Time PCR method to detect the expression of miR-29c-5p in 40 cases of gallbladder carcinoma and its adjacent tissues, it was found that the expression of miR-29c-5p was abnormally low in tumor tissues. It was also found that miR-29c-5p was closely related to the prognosis of gallbladder cancer patients. In vivo and in vitro experiments showed that miR-29c-5p could regulate the proliferation and inhibit the invasion and metastasis of gallbladder cancer cells. This phenomenon may be regulated by miR-29c-5p inhibiting epithelial interstitial transformation (EMT) of gallbladder cancer cells. Identification of target genes of MiR-29c-5p: combined with bioinformatics prediction such as miRDB and miRanda and double luciferase reporter gene method, the binding of miR-29c-5p to target gene 3'UTR was detected. The inhibitory effect of Western blot on target gene was detected at protein level, and the relationship between SPOCK1 gene and prognosis of gallbladder carcinoma was detected by immunohistochemistry. The role of SPOCK1 as a target gene of miR-29c-5p in the biological function of miR-29c-5p: the role of SPOCK1 in the proliferation, invasion and metastasis of cholecyst carcinoma cells by miR-29c-5p-SPOCK1 overexpression plasmid and miR-29c-5p co-transfection were used for Transwell assay. Western blot was used to verify the EMT related indexes. Results 1. By the differential expression detection of gallbladder carcinoma, miRNA; related to gallbladder carcinoma with miR-29c-5p as the core was determined. 2. In vitro and in vivo experiments showed that the overexpression of miR-29c-5p inhibited the invasion and metastasis of gallbladder cancer cells by regulating EMT, and inhibited the proliferation of gallbladder cancer cells, 3SPOCK1 was confirmed as the target gene of miR-29c-5p. 4 SPOCK1 plays an oncogene role in gallbladder carcinoma and plays a key role in the inhibition of miR-29c-5p. Conclusion MiR-29c-5p plays a key role in the growth and metastasis of gallbladder carcinoma by targeting SPOCK1, suggesting that intervention of miR-29c-5p may be an important part in the treatment of gallbladder carcinoma.
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.8

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本文編號：2397603