【摘要】：目的:在酵母細(xì)胞中異體表達(dá)人類抑癌蛋白p53并探討利用酵母檢測p53功能的可能性。方法:以乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(含野生型p53)的RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增野生型p53基因并克隆于受半乳糖誘導(dǎo)的酵母表達(dá)質(zhì)粒pRS426Gal1/10中,使用定點(diǎn)突變構(gòu)建突變型p53(R248W、G245S、R273H和R249S),經(jīng)測序確認(rèn)后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞,觀察p53誘導(dǎo)表達(dá)后酵母細(xì)胞的凋亡和生長狀況。利用蛋白印跡(Western blot)檢測不同誘導(dǎo)時間p53的表達(dá),應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測DNA斷裂、Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻指示細(xì)胞凋亡。結(jié)果:野生型p53誘導(dǎo)3小時后酵母菌即出現(xiàn)生長抑制,誘導(dǎo)9小時后可檢測到p53表達(dá),并隨時間延長表達(dá)增加,生長抑制更甚,酵母細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡表型。而表達(dá)突變型p53(R248W、G245S、R273H和R249S)的酵母細(xì)胞則未觀察到明顯的凋亡和生長抑制。結(jié)論:酵母可異體表達(dá)人類抑癌蛋白p53,依據(jù)酵母細(xì)胞的生長狀況可反映p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。
[Abstract]:Aim: to express human tumor suppressor protein p53 in yeast cells and explore the possibility of detecting p53 function by yeast. Methods: the RNA reverse transcription product (cDNA) of breast cancer cell line MCF-7 (containing wild type p53) was used as template, and the wild type p53 gene was amplified by PCR and cloned into the yeast expression plasmid pRS426Gal1/10 induced by galactose. The mutant p53 (R248WN G245SN R273H and R249S) was constructed by site-directed mutation. The plasmid was transformed into yeast cells by sequencing. The apoptosis and growth of yeast cells induced by p53 were observed. Western blot (Western blot) was used to detect the expression of p53 at different induction time, in situ end labeling (TUNEL) was used to detect DNA fragmentation, and Annexin V-FITC/PI method was used to detect cell membrane phosphatidyl serine valgus (Phosphatidyl serine valgus) indicating cell apoptosis. Results: three hours after induction of wild type p53, the growth inhibition appeared in yeast, and the expression of p53 was detected after 9 hours of induction. The expression of p53 increased with time, and the growth inhibition was more serious. The typical apoptotic phenotype appeared in yeast cells. But the yeast cells expressing mutant p53 (R248WN G245SU R273H and R249S) showed no obvious apoptosis and growth inhibition. Conclusion: yeast can express human tumor suppressor protein p53 in vivo, which can reflect the function of p53 induced apoptosis according to the growth status of yeast cells.
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.2

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本文編號：2396357