【摘要】：金屬納米簇(metal nanoclusters)是一類由數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)原子組成,結(jié)構(gòu)介于單金屬原子和納米顆粒之間的金屬納米團(tuán)簇,它的獨(dú)特結(jié)構(gòu)賦予其熒光量子產(chǎn)率高、熒光穩(wěn)定性好等優(yōu)越的熒光性質(zhì),同時(shí)也具有生物毒性低、水溶性好等優(yōu)勢(shì),這些特性使得金屬納米簇作為一類新型免標(biāo)記熒光材料在熒光分析和熒光成像等領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注和研究。其中,利用DNA為模板合成的銀納米簇?zé)晒庑再|(zhì)優(yōu)良,通過(guò)改變DNA序列可產(chǎn)生可見到近紅外區(qū)間熒光發(fā)射帶的不同銀納米簇,引起了科研工作者特別的重視。利用銀納米簇模板DNA本身是核酸的屬性,很多可用來(lái)操控核酸的工具酶也可以引入到這種免標(biāo)記的熒光探針中來(lái)�；贒NA分子與不同靶標(biāo)的特異識(shí)別能力(如核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,核酸適體與目標(biāo)物的結(jié)合等),這種免標(biāo)記的熒光探針也可用于核酸、離子、小分子、蛋白質(zhì)、甚至細(xì)胞的檢測(cè)�；诖�,本論文以DNA穩(wěn)定的銀納米簇為研究對(duì)象,一方面利用其熒光作為信號(hào)來(lái)源,結(jié)合核酸工具酶放大技術(shù)將其應(yīng)用于核酸的免標(biāo)記靈敏檢測(cè)；另一方面,通過(guò)合成模板序列的優(yōu)化,篩選出一條可高效合成銀納米簇的DNA模板,并通過(guò)在DNA模板上延長(zhǎng)一段腫瘤細(xì)胞的aptamer序列,進(jìn)一步將其運(yùn)用于腫瘤細(xì)胞的免標(biāo)記檢測(cè)。主要研究?jī)?nèi)容如下：一、基于DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇結(jié)合核酸外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)放大用于DNA的免標(biāo)記檢測(cè)研究DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇因具備合成簡(jiǎn)便、成本低廉、熒光強(qiáng)度大及熒光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),常被用于構(gòu)建免標(biāo)記的熒光分子探針；然而,其合成需要高濃度DNA模板(微摩爾)使得基于銀納米簇的分析方法檢測(cè)靈敏度受限。利用銀納米模板是核酸的特性,結(jié)合一些核酸工具酶輔助的信號(hào)放大技術(shù),能夠有效地克服該缺陷。在本工作中,基于銀納米簇對(duì)DNA模板構(gòu)型和序列的依賴性及外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)放大作用,我們發(fā)展了一種免標(biāo)記、靈敏的核酸檢測(cè)方法。在本方法中,我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)核酸探針,一個(gè)是包含銀納米簇合成模板的3’突出發(fā)夾序列(HP)；一個(gè)是含有能打開HP的3’突出雙鏈序列(P/HB)。當(dāng)靶標(biāo)DNA不存在時(shí),銀納米簇的模板被固定在HP發(fā)夾的莖部,此雙鏈結(jié)構(gòu)不能介導(dǎo)銀納米簇的合成。當(dāng)靶標(biāo)DNA存在時(shí),靶標(biāo)能與P/HB探針結(jié)合形成雙鏈平齊末端,此時(shí)外切酶Ⅲ能特異識(shí)別該平齊末端并逐漸水解完整的雙鏈部分,同時(shí)釋放出靶標(biāo)DNA和P鏈。釋放的靶標(biāo)DNA即可進(jìn)行重復(fù)水解循環(huán)。釋放的P鏈可以進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)打開HP發(fā)夾結(jié)構(gòu)并形成雙鏈平齊末端,外切酶Ⅲ又能特異識(shí)別平齊末端產(chǎn)生新的水解,生成銀納米簇模板DNA (T-DNA),同時(shí)釋放出P繼續(xù)進(jìn)行該循環(huán)產(chǎn)生更多的T-DNA。最終大量的銀納米簇模板被釋放,該模板能特異介導(dǎo)銀納米簇的合成,從而表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光信號(hào)。通過(guò)熒光信號(hào)的測(cè)量即可檢測(cè)靶標(biāo)DNA的含量。該方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、無(wú)需標(biāo)記,具有良好的選擇性和靈敏度,為核酸的檢測(cè)方法提供一種思路。二、DNA穩(wěn)定的超強(qiáng)熒光銀納米簇的合成及其用于腫瘤細(xì)胞的免標(biāo)記檢測(cè)研究DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇對(duì)模板DNA序列和構(gòu)型具有高度依賴性,不同的DNA模板制備出的銀納米簇?zé)晒庑再|(zhì)差別很大,比如熒光強(qiáng)度和光譜位置的變化。銀納米簇也存在一些缺點(diǎn),如DNA模板需求濃度高,部分序列合成的銀納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度較低且穩(wěn)定性差,因而限制了銀納米簇在檢測(cè)方面的靈敏性以及在復(fù)雜生物樣品中的應(yīng)用。為進(jìn)一步探討DNA模板對(duì)銀納米簇合成的影響和擴(kuò)寬DNA穩(wěn)定的銀納米簇的應(yīng)用領(lǐng)域,在本工作中我們首先篩選出了一條可以合成超強(qiáng)熒光銀納米簇的DNA模板序列,其熒光強(qiáng)度超過(guò)目前己報(bào)道的絕大部分以DNA為模板合成的銀納米簇,而且其光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,抗光漂白性能力強(qiáng)。然后,在該模板的序列的基礎(chǔ)上,延伸一段可特異性識(shí)別CCRF-CEM細(xì)胞的aptamer(sgc8c),構(gòu)建了一種免標(biāo)記的熒光探針用于腫瘤細(xì)胞的靈敏檢測(cè)。通過(guò)對(duì)比連接aptamer序列前后模板合成的銀納米簇的光譜性質(zhì),發(fā)現(xiàn)aptamer的加入并沒有影響模板序列對(duì)銀納米簇的合成,之后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明銀納米簇模板序列的加入不會(huì)影響aptamer對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別效果。因此,該模板序列穩(wěn)定的銀納米簇有望在不同領(lǐng)域作為免標(biāo)記探針得到更廣泛的應(yīng)用,同時(shí)也有望成為一種新的熒光探針應(yīng)用于其他腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及成像。
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【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.43
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本文編號(hào)：2393888