【摘要】：目前為止,肺癌治療取得了一些進(jìn)步,但是肺癌仍是目前發(fā)病率最高的惡性腫瘤,特別是中晚期肺癌預(yù)后差,傳統(tǒng)放化療方案不敏感抑或容易發(fā)生腫瘤耐藥,因此,開發(fā)新的肺癌治療策略依然是我們面臨的任務(wù)。天然產(chǎn)物是抗癌劑開發(fā)的重要來源,如從紫杉樹皮提取的紫杉醇和從長(zhǎng)春花中提取的長(zhǎng)春新堿均已被廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤治療。血根堿(Sanguinarine,SAN)是一種來自中藥博落回或白屈菜的生物堿。以往的研究表明血根堿具有抗菌、抗炎等多種生物學(xué)活性。近來研究結(jié)果顯示血根堿對(duì)前列腺癌、骨肉瘤、乳腺癌等具有抗腫瘤作用。提示該化合物可能應(yīng)用于肺癌的治療,但是,其抗腫瘤作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步明確。癌細(xì)胞由于快速代謝和生長(zhǎng)的需要,通常表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)、有絲分裂應(yīng)激(Mitotic stress)、代謝應(yīng)激(Metabolic stress)及氧化應(yīng)激(Reactive oxygen species,ROS)等細(xì)胞內(nèi)一系列適應(yīng)性反應(yīng)。目前認(rèn)為,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等具有促存活、促死亡的雙重作用。一方面腫瘤細(xì)胞往往依賴于應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)的調(diào)控蛋白來支持自身的生存;而另一方面某些藥物比如紫杉醇、5-氟尿嘧啶、硼替佐米等化療藥物可以通過誘導(dǎo)過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮其促凋亡作用,從而發(fā)揮抗腫瘤作用�；钚匝醮�(Oxidative Stress,OS)作為信號(hào)分子多方面參與了某些細(xì)胞功能的調(diào)控與執(zhí)行,在決定細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。ROS可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn),人們?cè)噲D通過增加ROS的生成達(dá)到治療腫瘤的目的。同時(shí),多個(gè)研究指出ROS可以增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與ROS可以互為因果關(guān)系。因此,ROS的產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞死亡中的作用引起了廣泛關(guān)注。本論文觀察血根堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,通過檢測(cè)ROS的產(chǎn)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá),分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與ROS的交互調(diào)節(jié)作用,探討血根堿抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制,及為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法(1)收集肺腺癌組織病理標(biāo)本,免疫組化染色檢查GRP78、CHOP蛋白表達(dá)。(2)人肺腺癌細(xì)胞株spc-a1從中國(guó)科學(xué)院獲得。利用mtt法分析血根堿對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株spc-a1的存活率的影響;hoechst33258染色、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變;westernblot法檢測(cè)bax、cleaved-caspase-3、p-parp-1等凋亡、應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。(3)cm-h2dcfda染色并利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察血根堿處理后spc-a1細(xì)胞內(nèi)的ros水平;觀察抗氧化物n-乙酰半胱氨酸(nac)對(duì)血根堿抑制spc-a1細(xì)胞增殖作用及血根堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的影響。(4)采用rt-pcr法分析與未折疊蛋白積累相關(guān)的84個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá),基因的表達(dá)變化以熱圖形式顯示;westernblot法檢測(cè)grp78、p-perk、p-eif2α、atf-4、chop等凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá);mtt法與hoechst33258染色法,觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑tudca對(duì)血根堿抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的影響。(5)cm-h2dcfda染色觀察tudca聯(lián)合血根堿作用后spc-a1細(xì)胞中ros水平的變化;westernblot法分析nac聯(lián)合血根堿對(duì)細(xì)胞中g(shù)rp78、chop蛋白表達(dá)的影響。(6)各組數(shù)據(jù)均值采用x2±sd表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用spss11.5軟件分析。結(jié)果1.肺腺癌組織病理標(biāo)本內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白grp78、chop的表達(dá)。我們對(duì)來自肺癌患者,并經(jīng)病理學(xué)醫(yī)生確診的人肺腺癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。grp78陽性部位定位于細(xì)胞胞漿,而chop陽性表達(dá)除了胞漿外,在胞核內(nèi)也出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。而在癌旁組織只見肺泡巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色染色,而在其他細(xì)胞內(nèi)未見明顯的變化。提示grp78與chop等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的平衡與人肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。2.血根堿抑制人肺腺癌細(xì)胞株spc-a1的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了測(cè)定血根堿對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株spc-a1生長(zhǎng)的抑制作用,我們采用不同劑量的血根堿(0.5、1、2和4μm))處理細(xì)胞24小時(shí)。利用mtt法分析其細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示,血根堿可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并呈現(xiàn)劑量依賴性。利用hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡的變化,發(fā)現(xiàn)分別用0.5、1、2和4μm血根堿處理細(xì)胞24小時(shí)后,人肺腺癌細(xì)胞株spc-a1的細(xì)胞核發(fā)生染色質(zhì)濃聚、核碎裂等明顯的凋亡改變,提示血根堿可通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡發(fā)揮其抗癌活性。3.血根堿誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株spc-a1產(chǎn)生ros應(yīng)用血根堿(1、2μm)處理細(xì)胞24小時(shí)后,應(yīng)用cm-h2dcfda染色和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ros的水平。結(jié)果表明,隨著血根堿濃度的增高,細(xì)胞內(nèi)的ros均顯著增高,并呈現(xiàn)劑量依賴性的特點(diǎn)。將spc-a1細(xì)胞采用100μmn-乙酰半胱氨酸(nac)預(yù)處理1小時(shí),能顯著抑制血根堿誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,同時(shí)也減少了血根堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明,血根堿介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制與凋亡部分依賴于ros的產(chǎn)生。因此,ros的產(chǎn)生與血根堿誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡密切相關(guān)。4.血根堿誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了凋亡我們使用rt-pcr檢測(cè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的變化。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),血根堿(2μm,24h)處理spc-a1細(xì)胞后,32個(gè)基因表達(dá)上調(diào)2倍以上,包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(grp78),α需肌醇激酶1(ire1αern1),激活轉(zhuǎn)錄因子6(atf6α),激活轉(zhuǎn)錄因子4(atf4),生長(zhǎng)抑制和dna損傷誘導(dǎo)基因34(gadd34,ppp1r15a)和caat/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(chop,ddit3)。進(jìn)一步應(yīng)用western印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá),實(shí)驗(yàn)證實(shí):血根堿以劑量依賴的方式增加grp78、磷酸化蛋白激酶r(pkr)樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(perk),p-eukaryotic翻譯起始因子2(p-eif2α),atf4和chop蛋白的表達(dá)。因此,血根堿可以誘導(dǎo)spc-a1細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為在與細(xì)胞死亡相關(guān)的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)血根堿誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的影響,我們采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑tudca預(yù)處理細(xì)胞(50μm,1h),mtt法檢測(cè)細(xì)胞存活率,hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡。mtt法與hoechst染色法結(jié)果表明,tudca可部分逆轉(zhuǎn)血根堿誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與血根堿誘導(dǎo)的spc-a1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡具有相關(guān)性。5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與ros在肺癌細(xì)胞存活與凋亡過程中的關(guān)系ros引起氧化應(yīng)激,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過未折疊蛋白和/或錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚激活未折疊蛋白反應(yīng),其中涉及多種分子。我們同時(shí)也在探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與ros之間的關(guān)系,確定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與調(diào)節(jié)ros的產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn):用50μm內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑tudca預(yù)處理spc-a1細(xì)胞1小時(shí),然后繼續(xù)加入血根堿2μm處理細(xì)胞24h,與單獨(dú)加入血根堿組比較有部分逆轉(zhuǎn)血根堿誘導(dǎo)產(chǎn)生ros的現(xiàn)象。同時(shí),用ros阻斷劑nac預(yù)處理spc-a1細(xì)胞(100μm,1h),然后繼續(xù)加入血根堿處理細(xì)胞(2μm,24h),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白grp78和chop的表達(dá)較單獨(dú)加入血根堿組明顯減弱。這些數(shù)據(jù)表明,藥物阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能降低ros的產(chǎn)生,而nac清除ros可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ros的產(chǎn)生相互促進(jìn),形成惡性循環(huán)。結(jié)論1.人肺腺癌組織高表達(dá)grp78與chop等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白與腫瘤周圍的癌旁組織相比,grp78陽性部位定位于細(xì)胞胞漿,而chop陽性表達(dá)除了胞漿外,在胞核內(nèi)也出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)與人肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。2.血根堿通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人肺腺癌細(xì)胞株spc-a1的增殖血根堿降低細(xì)胞活力,并呈劑量依賴性。hoechst染色結(jié)果顯示,隨著血根堿劑量增加,細(xì)胞凋亡率顯著升高。3.ros參與了血根堿誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡血根堿能夠劑量依賴性地增加ros的產(chǎn)生;抗氧化劑nac通過抑制血根堿誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞的凋亡,進(jìn)一步確認(rèn)血根堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與其氧化應(yīng)激作用密切相關(guān)。4.血根堿通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞凋亡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)分子pcr-array方法與免疫印記的方法結(jié)果顯示:血根堿能夠增加grp78,p-perk,ire1a和atf6a等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的分子mrna與蛋白的表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑tudca減弱了血根堿誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡。提示血根堿激活了人肺腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。5.氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的交互作用是血根堿抗腫瘤作用的主要機(jī)制我們分別采用ros清除劑nac與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑tudca,發(fā)現(xiàn)血根堿誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠增強(qiáng)ros的產(chǎn)生;反過來,血根堿誘導(dǎo)的ros也能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。因此,氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間形成的惡性反饋循環(huán)可能是血根堿抑制肺癌細(xì)胞增殖的主要機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2392758