【摘要】：目的:超過90%的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞癌(HCC),HCC的預(yù)后較差。雖然手術(shù)治療仍是迄今為止最有效的治療,但大多數(shù)HCC患者被診斷時處于晚期,不能接受手術(shù)治療,而未經(jīng)治療的患者5年存活率僅為5%。因此,探索HCC新的治療靶點以發(fā)掘HCC新的有效可行的治療方法是至關(guān)重要的。PI3K/AKT/m TOR信號通路已經(jīng)被越來越多的研究證明其在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。AKT是PI3K/AKT/m TOR信號通路的重要橋梁點,已經(jīng)有證據(jù)表明其對調(diào)節(jié)細(xì)胞活力信號方面起重要作用,并且與各種增殖性疾病密切相關(guān)。許多數(shù)據(jù)表明,單一AKT的亞型(即AKT1,AKT2和AKT3)在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中具有不同甚至相反的功能。AKT同種異型可能對癌癥傳播具有不利影響。AKT家族,也叫絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,特別是AKT1亞型已被確定在HCC細(xì)胞中異常表達(dá),并且與細(xì)胞行為(包括增殖,存活,代謝和腫瘤發(fā)生)高度相關(guān)。然而,AKT1的調(diào)節(jié)具體機制需要進(jìn)一步研究。我們的研究的目的是揭示AKT1對HCC細(xì)胞增殖和遷移的影響,并調(diào)查其所涉及的機制。方法:用TRIzol試劑從HCC細(xì)胞(SMMC-7721,HepG2)中提取總RNA,SYBR Premix Ex Taq試劑對c DNA樣品進(jìn)行實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測基因的表達(dá)。我們使用RT-PCR來評估兩個HCC細(xì)胞系(SMMC-7721和Hep G2)中AKT1的表達(dá)水平。按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取空白質(zhì)粒和AKT1-RNAi質(zhì)粒。提取出來的質(zhì)粒用Effectene轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后,用PT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。Western blot用來檢測AKT1對分子蛋白調(diào)節(jié)機制的影響,MTT法檢測AKT1的表達(dá)對HCC細(xì)胞生長增殖的影響,細(xì)胞劃痕實驗用來檢測SMMC-7721和Hep G2細(xì)胞的遷移能力。所有實驗重復(fù)三次。結(jié)果:與正常肝細(xì)胞系HL-7702中的表達(dá)水平相比,SMMC-7721和HepG2肝癌細(xì)胞系中AKT1的表達(dá)明顯顯著上調(diào)(**p0.01)。然后我們評估了下調(diào)質(zhì)粒(AKT1-RNAi質(zhì)粒)的轉(zhuǎn)染效率。相應(yīng)結(jié)果是下調(diào)質(zhì)粒抑制了AKT1的表達(dá),表明轉(zhuǎn)染有效。進(jìn)行MTT測定以了解AKT1在HCC細(xì)胞增殖中的作用,結(jié)果顯示AKT1-RNAi質(zhì)粒下調(diào)AKT1的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖(p0.05)。AKT1-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SMMC-7721和Hep G2細(xì)胞的傷口愈合的能力明顯顯著降低(**p0.01)。此外,封閉AKT1后可通過抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活和下調(diào)MMP-2、MMP-9的活性和表達(dá)來抑制HCC細(xì)胞系的增殖和遷移。(**p0.01)。在Western免疫印跡實驗中,與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,敲除AKT1蛋白對NF-κB、MMP-2和MMP-9表達(dá)有明顯的影響。相于空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,AKT1-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-2和MMP-9活性較低(**p0.01)。與此同時,我們發(fā)現(xiàn),在HCC細(xì)胞中下調(diào)AKT1抑制了其介導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)和分泌(**p0.01)。結(jié)論:我們的研究結(jié)果顯示AKT1在HCC細(xì)胞系的增殖和遷移中起重要作用。阻斷AKT1能抑制NF-κB的表達(dá)水平和肝癌的發(fā)展。我們的結(jié)果表明了沉默AKT1表達(dá)可能通過抑制SMMC-7721和Hep G2細(xì)胞中的NF-κB的激活下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平和催化活性,從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖及遷移。靶向封閉AKT1后,抑制了肝癌細(xì)胞的增殖及遷移,因此以它作為腫瘤的靶標(biāo)具有潛在的應(yīng)用價值。
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【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2387649