【摘要】：目的:探討唑來(lái)膦酸對(duì)HCT116細(xì)胞的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制。方法:1)采用CCK-8方法檢測(cè)不同濃度唑來(lái)膦酸對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的作用,不同濃度唑來(lái)膦酸孵育HCT116細(xì)胞72h后,測(cè)定細(xì)胞存活率,并計(jì)算IC50值;2)采用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀(guān)察唑來(lái)膦酸對(duì)HCT116細(xì)胞克隆形成能力的影響;3)采用流式細(xì)胞分析術(shù)分析25μmol/L和50μmol/L的唑來(lái)膦酸作用HCT116細(xì)胞48h后細(xì)胞的凋亡比例;4)25μmol/L和50μmol/L唑來(lái)膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、48h和72h后,用線(xiàn)粒體膜電位特異性染料JC-1避光孵育細(xì)胞15min,采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析其紅色熒光強(qiáng)度的變化;5)Western blot方法分析唑來(lái)膦酸作用HCT116細(xì)胞72h后,細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)cytochrome C含量的改變以及胞漿內(nèi)caspase-3的活化情況;6)建立HCT116細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,并觀(guān)測(cè)給藥唑來(lái)膦酸后腫瘤生長(zhǎng)、瘤塊重量及腫瘤組織形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果:1)唑來(lái)膦酸可抑制HCT116細(xì)胞的增殖,并具有劑量依賴(lài)性,IC50=26.79μmol/L;2)IC50濃度的唑來(lái)膦酸可顯著抑制HCT116細(xì)胞克隆的形成;3)唑來(lái)膦酸25μmol/L和50μmol/L作用HCT116細(xì)胞48h后,HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡,凋亡比例分別為11.6%±0.5%、49.2%±3.4%,p0.05;4)25μmol/L和50μmol/L唑來(lái)膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、48h和72h后,熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果顯示JC-1被激發(fā)出的紅色熒光強(qiáng)度顯著降低,流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示被激發(fā)出JC-1紅色熒光的細(xì)胞比例顯著減少:25μmol/L唑來(lái)膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、48h和72h后,JC-1紅色熒光細(xì)胞的比例分別為96.49%±2.1%、86.13%±3.2%、74.23%±5.3%,p0.05;50μmol/L唑來(lái)膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、48h和72h后,JC-1紅色熒光細(xì)胞的比例分別為55.21%±5.9%、66.65%±2.3%、38.71%±4.3%,p0.05;5)Western blot結(jié)果顯示25μmol/L和50μmol/L唑來(lái)膦酸作用HCT116細(xì)胞72h后,線(xiàn)粒體中cytochrome C減少,胞漿中cytochrome C增多,同時(shí),活化的caspase 3增多。說(shuō)明cytochrome C從線(xiàn)粒體內(nèi)釋放至胞漿,并最終激活了Caspase-3;6)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2mg/kg唑來(lái)膦酸治療可顯著抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng),末次測(cè)量腫瘤體積對(duì)照組為2289.4±363.8mm3,唑來(lái)膦酸組為926.42±238.3mm3;試驗(yàn)結(jié)束后剝離腫瘤組織,對(duì)照組、2mg/kg唑來(lái)膦酸治療組的平均瘤重分別為2.53±0.33g、1.65±0.31g,唑來(lái)膦酸組腫瘤體積顯著小于對(duì)照組,抑瘤率為:34.8%;移植瘤的組織形態(tài)學(xué)檢查顯示唑來(lái)膦酸誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)論:唑來(lái)膦酸能抑制HCT116細(xì)胞增殖和克隆形成,其機(jī)制是通過(guò)使線(xiàn)粒體跨膜電位下降,通透性增強(qiáng),導(dǎo)致cytochrome C由線(xiàn)粒體釋放至細(xì)胞漿,最終激活了caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明唑來(lái)膦酸可抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng),誘導(dǎo)腫瘤組織發(fā)生凋亡。該研究為ZOL作為結(jié)直腸癌治療藥物的開(kāi)發(fā)與臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:Aim: to investigate the biological effect of zoledronic acid on HCT116 cells and its molecular mechanism. Methods: 1) the effects of zoledronic acid at different concentrations on the proliferation of HCT116 cells were detected by CCK-8 method. After incubated with zoledronic acid for 72 hours, the survival rate of HCT116 cells was measured and the IC50 value was calculated. 2) the effect of zoledronic acid on the clonal formation of HCT116 cells was observed by clone formation assay, 3) the apoptotic ratio of HCT116 cells treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 48 h was analyzed by flow cytometry. 4) after treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 24 h and 72 h, the cells were incubated with mitochondrial membrane potential specific dye JC-1 for 15 min. The changes of red fluorescence intensity were analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry. 5) Western blot method was used to analyze the changes of cytochrome C content in mitochondria and cytoplasm and the activation of caspase-3 in cytoplasm of HCT116 cells treated with zoledronic acid for 72 hours. 6) the model of transplanted tumor of HCT116 cells in nude mice was established, and the tumor growth, tumor mass weight and tumor histomorphology were observed after administration of azoledronic acid. Results: 1) Zoledronic acid inhibited the proliferation of HCT116 cells in a dose-dependent manner, and zoledronic acid at the concentration of IC50=26.79 渭 mol/L;2 significantly inhibited the clone formation of HCT116 cells. 3) after treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L of zoledronic acid for 48 h, the apoptosis of HCT116 cells was 11.6% 鹵0.5% and 49.2% 鹵3.4%, respectively. 4) after treatment of HCT116 cells with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 48 h and 72 h, the results of fluorescence microscopy showed that the red fluorescence intensity induced by JC-1 was significantly decreased. The results of flow cytometry showed that the percentage of cells stimulated with JC-1 red fluorescence was significantly decreased: the percentage of JC-1 red fluorescent cells was 96.49% 鹵2.1 after treatment with 25 渭 mol/L zoledronic acid for 24 h and 72 h, respectively. 86.13% 鹵3.2% and 74.23% 鹵5.3%. After treatment with 50 渭 mol/L zoledronic acid for 24 h or 72 h, the percentage of JC-1 red fluorescent cells was 55.21% 鹵5.9% 鹵6.65% 鹵2.3% and 38.71% 鹵4.3% respectively. 5) Western blot results showed that after treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 72 h, cytochrome C in mitochondria decreased, cytochrome C in cytoplasm increased and activated caspase 3 increased. The results showed that cytochrome C was released from mitochondria to cytoplasm and Caspase-3; was activated. 6) the results of in vivo experiments showed that 2mg/kg zoledronic acid could significantly inhibit tumor growth in mice. The tumor volume in the last tumor control group was 2289.4 鹵363.8mm ~ (-3) mm ~ (-3), and that in the zoledronic acid group was 926.42 鹵238.3 mm ~ (-3). The mean tumor weight of the control group and 2mg/kg zoledronic acid treatment group was 2.53 鹵0.33 g / L 1.65 鹵0.31 g respectively, and the tumor volume of zoledronic acid group was significantly smaller than that of the control group (34.8%). Histological examination of transplanted tumor showed that zoledronic acid induced apoptosis of tumor cells. Conclusion: zoledronic acid can inhibit the proliferation and clone formation of HCT116 cells through the decrease of mitochondrial transmembrane potential and the enhancement of permeability, resulting in the release of cytochrome C from mitochondria to the cytoplasm and the activation of caspase-3, to induce apoptosis. Animal experiments have shown that zoledronic acid can inhibit tumor growth and induce apoptosis in tumor tissues. This study provides a theoretical basis for the development and clinical application of ZOL as a therapeutic drug for colorectal cancer.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2379250