發(fā)布時(shí)間：2018-12-14 15:17

【摘要】：研究背景:叉頭框轉(zhuǎn)錄因子F2(forkhead box F2,FOXF2)屬于間質(zhì)特異性轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞極性維持組織穩(wěn)態(tài),在胚胎發(fā)育和組織分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),FOXF2在基底細(xì)胞樣乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)中特異性表達(dá);FOXF2低表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促進(jìn)BLBC轉(zhuǎn)移,但卻抑制癌細(xì)胞增殖。多項(xiàng)研究證實(shí)FOXF2在其他腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用,但是調(diào)控腫瘤中FOXF2特異性表達(dá)的分子機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析FOXF2近端啟動(dòng)子的DNA序列,發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子上存在一個(gè)Cp G島,且Cp G島中存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子SP1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。因此,我們推測(cè)DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄因子SP1協(xié)同調(diào)節(jié)FOXF2在不同乳腺癌細(xì)胞亞型中表達(dá)及其在乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用。目的本研究旨在闡明DNA甲基化通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子SP1與FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合而調(diào)控FOXF2在不同乳腺癌細(xì)胞亞型中表達(dá)的分子機(jī)制,以及其在FOXF2介導(dǎo)的SP1調(diào)控乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖中的作用。研究方法:1、采用亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法檢測(cè)luminal亞型乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-453、basal-like亞型乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和永生化乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A、以及20例乳腺原發(fā)癌組織中FOXF2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度。同時(shí),采用RT-QPCR方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中FOXF2 m RNA的表達(dá)水平,Western blot方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中FOXF2蛋白的表達(dá)水平。分析FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度與其表達(dá)水平的相關(guān)性。2、為了研究DNA甲基化對(duì)FOXF2表達(dá)的影響,分別用濃度梯度為0、0.5、1、1.5、2和2.5μM的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-aza-d C)作用于乳腺癌細(xì)胞,然后通過(guò)RT-QPCR和Western blot方法檢測(cè)FOXF2表達(dá)水平的改變。3、為了研究細(xì)胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)對(duì)FOXF2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,分別采用小干擾RNA(small interference RNA,si RNA)沉默F(xiàn)OXF2啟動(dòng)子高甲基化的MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá),然后通過(guò)RT-QPCR和Western blot方法檢測(cè)FOXF2表達(dá)的變化。同時(shí),通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecitation,Ch IP)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B與甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合。4、為了研究DNA甲基化是否可以直接抑制FOXF2啟動(dòng)子的活性,分別用甲基轉(zhuǎn)移酶Sss I,Hha I和Hpa II體外催化FOXF2啟動(dòng)子 655 bp至+128 bp的區(qū)域發(fā)生不同程度的甲基化修飾,然后克隆入p GL3-basic載體,并轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,最后采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)不同甲基化程度的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。5、分別采用Ch IP和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SP1對(duì)FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活作用;為了分析SP1對(duì)FOXF2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,在MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SP1真核表達(dá)載體(SP1)或SP1si RNA(si SP1),以及采用SP1特異性抑制劑光輝霉素(Mithramycin,MTM)處理MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞,然后通過(guò)RT-QPCR和Western blot方法檢測(cè)FOXF2表達(dá)的變化。6、為了研究DNA甲基化對(duì)SP1轉(zhuǎn)錄激活FOXF2啟動(dòng)子活性的影響,用2μM的5-aza-d C處理MCF-7細(xì)胞,然后通過(guò)Ch IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP1與FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合能力的變化;SP1與不同甲基化狀態(tài)的FOXF2啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231后,采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)SP1對(duì)不同甲基化程度的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。7、為了研究FOXF2介導(dǎo)SP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用,分別在過(guò)表達(dá)SP1的MDA-MB-231細(xì)胞中降表達(dá)FOXF2,或在降表達(dá)SP1的MCF-10A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FOXF2,然后通過(guò)體外Transwell和MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變,并采用Western blot方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中SP1、FOXF2和FOXF2靶基因TWIST1的表達(dá)。8、為了研究SP1-FOXF2通路對(duì)不同亞型乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響,我們基于GEO(gene expression omnibus)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中一組427例乳腺癌患者的數(shù)據(jù)資料(登記號(hào)GSE25066),分別統(tǒng)計(jì)分析luminal亞型和Basal-like亞型乳腺癌患者中SP1(probe set No.214732_at)和FOXF2(probe set No.206377_at)m RNA的表達(dá)水平與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存(distant metastasis free survival,DMFS)的關(guān)系。結(jié)果:1、Basal-like亞型的MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中,FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度低于luminal亞型的MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞,而MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中FOXF2 m RNA和蛋白表達(dá)水平高于MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞�；贔OXF2 m RNA水平將20例乳腺癌組織分為FOXF2高表達(dá)組(FOXF2high;n=10)和FOXF2低表達(dá)組(FOXF2low;n=10),FOXF2high組中FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度顯著低于FOXF2low組(P=0.027)。證實(shí)乳腺癌中FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。2、在5-aza-d C處理的MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞中,FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度顯著降低,FOXF2的表達(dá)水平隨著5-aza-d C濃度的增加而升高;在5-aza-d C處理的MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中,FOXF2的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。證實(shí)乳腺癌中FOXF2啟動(dòng)子的甲基化是抑制其表達(dá)的重要因素。3、在MCF-7細(xì)胞中降表達(dá)DNMT1或DNMT3A可以上調(diào)FOXF2表達(dá)水平,而降表達(dá)DNMT3B對(duì)其表達(dá)水平?jīng)]有影響;在MDA-MB-453細(xì)胞中降表達(dá)DNMT1或DNMT3B可以上調(diào)FOXF2表達(dá)水平,而降表達(dá)DNMT3A對(duì)其表達(dá)水平?jīng)]有影響。Ch IP實(shí)驗(yàn)證明MCF-7細(xì)胞中DNMT1和DNMT3A與FOXF2啟動(dòng)子的Cp G島結(jié)合,而DNMT3B的結(jié)合十分微弱;MDA-MB-453細(xì)胞中DNMT1和DNMT3A與FOXF2啟動(dòng)子的Cp G島結(jié)合,而DNMT3B的結(jié)合十分微弱。證實(shí)不同的乳腺癌細(xì)胞系中DNMTs對(duì)FOXF2的表達(dá)抑制作用不同。4、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示,沒(méi)有甲基化的FOXF2啟動(dòng)子活性最高,甲基轉(zhuǎn)移酶Hha I和Hpa II催化的部分甲基化的FOXF2啟動(dòng)子活性次之,而甲基轉(zhuǎn)移酶Sss I催化的完全甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的活性最低。證實(shí)DNA甲基化可以直接抑制FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。5、Ch IP實(shí)驗(yàn)證明SP1可以與FOXF2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合;雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)SP1可以增強(qiáng)FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性;在FOXF2啟動(dòng)子低甲基化的MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中分別降表達(dá)或過(guò)表達(dá)SP1,FOXF2的表達(dá)也隨之降低或升高;MTM處理MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞后,FOXF2的表達(dá)水平隨著MTM濃度的升高而降低。證實(shí)SP1轉(zhuǎn)錄促進(jìn)FOXF2啟動(dòng)子低甲基化的乳腺癌細(xì)胞中FOXF2的表達(dá)。6、5-aza-d C處理MCF-7細(xì)胞后,Ch IP實(shí)驗(yàn)證明SP1與FOXF2啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力增強(qiáng)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SP1對(duì)完全甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有影響,但可以增強(qiáng)無(wú)甲基化和部分甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。證實(shí)DNA甲基化抑制SP1對(duì)FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活。7、過(guò)表達(dá)SP1可以降低MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力,下調(diào)FOXF2的靶基因TWIST1的表達(dá)水平,但增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力,而降表達(dá)FOXF2可以逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)SP1所導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變;降表達(dá)SP1可以增強(qiáng)MCF-10A細(xì)胞的遷移和侵襲能力,上調(diào)TWIST1的表達(dá)水平,但降低細(xì)胞增殖能力,而過(guò)表達(dá)FOXF2可以逆轉(zhuǎn)降表達(dá)SP1所導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。證實(shí)FOXF2介導(dǎo)SP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。8、根據(jù)FOXF2和SP1 m RNA的表達(dá)水平將427例病人分為SP1high/FOXF2high組(n=111),SP1low/FOXF2high組(n=65),SP1high/FOXF2low組(n=154)和SP1low/FOXF2low組(n=97)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,在basal-like亞型的乳腺癌患者中SP1low/FOXF2low組患者的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率比其他三組患者低(P=0.0018),在luminal亞型的乳腺癌患者中四組患者的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。證實(shí)SP1-FOXF2通路參與basal-like亞型乳腺癌的轉(zhuǎn)移,而與luminal亞型乳腺癌的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。結(jié)論:1、在乳腺癌中,DNA甲基化調(diào)控FOXF2在不同乳腺癌細(xì)胞亞型中表達(dá)。2、SP1轉(zhuǎn)錄激活FOXF2啟動(dòng)子的活性,而這種轉(zhuǎn)錄激活被DNA甲基化所抑制。3、在FOXF2啟動(dòng)子低甲基化的basal-like亞型乳腺癌細(xì)胞中,SP1促進(jìn)FOXF2的表達(dá),同時(shí)FOXF2介導(dǎo)SP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖的影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2378825