【摘要】：胃癌(Gastric Cancer,GC)發(fā)病率和死亡率均居全國癌癥發(fā)病和死亡的第二位,其早期診斷率和中晚期胃癌5年生存率均低于20%,近年胃癌發(fā)病呈現(xiàn)上升和年輕化趨勢。長鏈非編碼RNAs(Long Noncoding RNA,LncRNAs)是指各種長度大于200個核苷酸且不翻譯成蛋白質的RNA分子,在轉錄、轉錄后以及表觀遺傳等水平調(diào)控基因表達,廣泛參與機體的生理和病理過程。越來越多研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs與胃癌的發(fā)生、轉移、預后和耐藥性形成等有關,有望成為胃癌早期診斷和預后生物標志物,但lncRNAs發(fā)揮作用的機制尚未闡明。目的基于生物信息學,篩選胃癌相關lncRNAs及其功能性單核苷酸多態(tài)位點(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),在大樣本人群中驗證lncRNA遺傳變異與胃癌易感性的關聯(lián),并初步探討其生物學功能。方法1.生物信息學篩選:檢索并下載GEO數(shù)據(jù)庫中基于中國人群的胃癌相關芯片數(shù)據(jù)(GSE50710,GSE53137,GSE58828)。本研究整合多種數(shù)據(jù)庫(Ensembl,refseq,lncRNAdb.v2.0,GENCODE.v24,NONCODE2016,LNcipedia.v3.1,CCDS.v18)并去冗余,采用本地BLASTN算法對高通量芯片進行重注釋。然后通過生物信息學方法篩選出差異表達的胃癌相關lncRNAs并預測其功能,與microRNAs具有潛在結合位點的lncRNAs及其SNPs進入下一步的人群驗證。2.大樣本人群驗證:采用病例對照研究設計,用PASS 8.0.14(http://www.ncss.com/pass.html)計算所需樣本量,按年齡(±3歲)和性別以1:1進行個體匹配,收集470例醫(yī)院來源且經(jīng)病理學確診的胃癌患者及社區(qū)來源的470例正常對照的血液樣本。采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度分析法(PCR-RFLP)對lncRNAs基因及其SNP進行基因分型。采用SAS 9.1(SAS Institute Inc.,Cary,North Carolina,USA)軟件進行統(tǒng)計分析。Hardy-Weinberg在線分析工具對對照人群進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。MDR2.0軟件分析基因-環(huán)境交互作用。3.生物學功能初探:采用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測41例樣本血清中不同基因型lncRNA表達量。通過熒光素酶報告基因實驗檢驗SNP等位基因變異是否影響相應lncRNA與預測的miRNA的結合。結果1.本研究整合構建的蛋白編碼數(shù)據(jù)庫含120,018條記錄,長鏈非編碼RNAs數(shù)據(jù)庫含206,510條記錄。共篩選出189個胃癌相關差異表達lncRNAs,最終選擇4個具有潛在的miRNA結合功能的lncRNAs及其SNP進行后續(xù)的人群驗證,分別是lnc-EVX1-3:3(rs1859168)、lnc-MACC1-1:7(rs3815254)、lnc-AMFR-1:1(rs4784659)、lnc-ZNF33B-2:1(rs579501)。2.年齡、性別和飲酒在病例和對照組中的分布無統(tǒng)計學差異(P0.05),而吸煙和腫瘤家族史在病例組中的比例顯著高于對照組(P0.05)。多因素非條件logistic回歸分析結果顯示,調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒及腫瘤家族史后,在顯性(OR=0.64,95%CI:0.47-0.86)和隱性遺傳模型(OR=1.77,95%CI:1.34-2.35)中均觀察到rs1859168 A等位基因的變異與胃癌的發(fā)病風險降低存在統(tǒng)計學關聯(lián);在顯性(OR=0.42,95%CI:0.31-0.57)和加性模型(OR=0.52,95%CI:0.40-0.67)中均發(fā)現(xiàn)rs4784659T能夠降低胃癌的發(fā)病風險;同樣,顯性(OR=0.72,95%CI:0.52-0.98)和加性模型(OR=0.73,95%CI:0.56-0.97)也提示攜帶rs579501C等位基因的個體胃癌易感性較低;但在四種模型中均未發(fā)現(xiàn)rs3815254(CT)與胃癌發(fā)病風險之間存在統(tǒng)計學關聯(lián)(all P0.05)。3.基于顯性模型,分別對年齡(㩳50 vs.≥50)、性別(男vs.女)、吸煙(是vs.否)、飲酒(是vs.否)及腫瘤家族史(是vs.否)進行分層分析,并調(diào)整其余因素后,發(fā)現(xiàn)rs1859168A,rs579501G等位基因的變異僅在部分層中顯示能夠顯著降低胃癌的發(fā)病風險,而rs4784659T等位基因的變異在所有分層亞組中一致顯示與胃癌的發(fā)病風險降低有統(tǒng)計學關聯(lián),且這種保護作用在不吸煙人群(OR=0.23,95%CI:0.14,0.38)中相比吸煙人群(OR=0.65,95%CI:0.43,0.98)更明顯(P0.001)。4.最佳基因-環(huán)境交互作用模型表明具有吸煙史,腫瘤家族史,攜帶rs4784659 CC,rs1859168 CC/AC和rs579501AA人群患胃癌的風險是非上述組合人群的5.03倍(OR:5.03;95%CI:3.81-6.65)。5.雙熒光素酶報告基因實驗表明共轉染miR-5002-5p后,攜帶rs579501 A等位基因報告質粒的相對熒光素酶活性降低,而共轉染miR-5002-5p的抑制劑后,其相對熒光素酶活性升高。6.生物信息學預測結果顯示,rs4784659 G等位基因向A等位基因的變異,為hsa-miR-6852-3p與lnc-AMFR-1:1提供了結合位點,可能導致lnc-AMFR-1:1表達水平降低及hsa-miR-6852-3p的靶基因表達水平升高。7.qRT-PCR結果顯示,rs4784659 AG(0.52±0.33,n=14)和rs4784659 AA(0.21±0.14,n=9)基因型個體血漿中l(wèi)nc-AMFR-1:1的表達量(SX±)均低于rs4784659 GG(0.87±0.34,n=18)基因型個體(both P0.017)。結論1.rs4784659 T、rs579501 C和rs1859168 A等位基因變異均與胃癌易感性降低有潛在關聯(lián)。2.rs579501 A等位基因可能通過促進hsa-miR-5002-5p與lnc-ZNF33B-2:1的結合,進而抑制lnc-ZNF33B-2:1的表達,而rs4784659 G等位基因向A等位基因的變異是否影響hsa-miR-6852-3p與lnc-AMFR-1:1的結合,尚需進一步的生物學功能實驗驗證。3.本研究為胃癌的早期診斷和治療提供了潛在的生物標志物,為深入研究lncRNAs在胃癌發(fā)病中的作用和機制提供了重要線索。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2
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本文編號：2375817