發(fā)布時(shí)間：2018-12-11 20:14

【摘要】：惡性淋巴瘤是淋巴結(jié)和結(jié)外部位淋巴組織的免疫細(xì)胞腫瘤,來源于淋巴細(xì)胞或組織細(xì)胞的惡變,其中非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s lymphoma,NHL)較難治愈。經(jīng)過放化療目前該病的治愈率僅有25%,因此對(duì)于治療復(fù)發(fā)性、頑固性低度或?yàn)V泡性非霍奇金淋巴瘤的治療急需新的治療方案。在治療B細(xì)胞淋巴瘤時(shí),CD20分子是理想的靶抗原,表達(dá)于95%以上正常或惡化的B細(xì)胞表面。它起始表達(dá)于前B淋巴細(xì)胞(pre-B)階段,到B細(xì)胞終端分化成漿細(xì)胞前結(jié)束,一直被認(rèn)為是B系細(xì)胞表面特有的標(biāo)識(shí)�？笴D20單抗與B細(xì)胞上的CD20結(jié)合,并引發(fā)B細(xì)胞溶解的免疫反應(yīng),細(xì)胞溶解的可能機(jī)制包括補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)[2]。使用針對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤抗原CD20分子的單克隆抗體是治療非霍奇金淋巴瘤的重要方案。經(jīng)過全球的多中心臨床試驗(yàn)證實(shí)具有明顯提高腫瘤患者生存率、顯著提高患者生命質(zhì)量、延長(zhǎng)生命周期的療效,與目前國(guó)際上采用的標(biāo)準(zhǔn)腫瘤治療藥物比較,具有毒副反應(yīng)小的特點(diǎn)。迄今為止全球至少50萬非霍奇金淋巴瘤患者接受了抗CD20單克隆抗體的治療,而作為全球最成功的抗體藥物之一,由羅氏公司生產(chǎn)的用于治療非霍奇金淋巴瘤的利妥昔單抗注射液(中國(guó)進(jìn)口注冊(cè)商品名“美羅華”)[[I]],在2011年的全球銷量達(dá)到約60億美元,由此可見,開發(fā)此類藥物將會(huì)為腫瘤患者帶來極大的益處,并會(huì)為開發(fā)此類藥物的生物技術(shù)公司帶來巨大的的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)收益,具有廣闊的市場(chǎng)前景。本項(xiàng)目旨在構(gòu)建一種工程細(xì)胞珠,使其表達(dá)的活性成分即:重組抗CD20單克隆抗體具有與利妥昔單抗相同的氨基酸序列。根據(jù)文獻(xiàn)資料參照美羅華合成了包含信號(hào)肽在內(nèi)的重組抗CD20單克隆抗體的輕鏈和重鏈基因片段,并將其分別插入到p REA202哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中,構(gòu)建表達(dá)抗體輕鏈和重鏈的載體p REA202/REA202L和p REA202/REA202H。將構(gòu)建的表達(dá)抗體輕鏈和重鏈的載體經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染CHO-DG44細(xì)胞,經(jīng)G418抗性篩選陽(yáng)性克隆,再通過ELISA篩選高表達(dá)抗體的的克隆,之后用MTX逐步加壓篩選、克隆,最終獲得一株高表達(dá)抗體的細(xì)胞株CHO-REA202。對(duì)該工程細(xì)胞株的初步鑒定表明,表達(dá)產(chǎn)物為完整的抗CD20單抗,抗體表達(dá)能力可以達(dá)到20至23PCD(pg/cell/day)。以該細(xì)胞株建立細(xì)胞庫(kù),工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞復(fù)蘇后,進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng),考察工程細(xì)胞的穩(wěn)定性。根據(jù)研究結(jié)果,將種子細(xì)胞培養(yǎng)階段傳一次作為一代,生產(chǎn)培養(yǎng)階段每培養(yǎng)48小時(shí)作為一代。細(xì)胞傳代試驗(yàn)共傳代60代,分別取傳代0、10、20、40、60代的細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)考察。結(jié)果表明在CHO-REA202的傳代過程中:REA202蛋白輕重鏈基因的DNA序列未發(fā)上改變;REA202蛋白輕重鏈基因的拷貝數(shù)水平未發(fā)生明顯改變;細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、倍增時(shí)間和形態(tài)未發(fā)生明顯改變;REA202蛋白的表達(dá)水平未發(fā)生明顯改變。該結(jié)果表明工程細(xì)胞CHO-REA202具有良好的傳代穩(wěn)定性,符合《中國(guó)藥典》中對(duì)于細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性的要求。
[Abstract]:Malignant lymphoma is an immune cell tumor of the lymphoid tissue of the lymph node and the junction, which is derived from the malignant transformation of lymphocytes or histiocytes, of which the non-Hodgkin's lymphoma (NHL) is more difficult to cure. The cure rate of the disease is only 25% after radiotherapy and chemotherapy, and therefore, a new treatment scheme is needed for the treatment of recurrent, intractable low-grade or follicular non-Hodgkin's lymphoma. In the treatment of B-cell lymphoma, the CD20 molecule is an ideal target antigen, expressed above 95% of the normal or deteriorated B-cell surface. It is initially expressed in the pre-B-lymphocyte (pre-B) stage, and the end of the differentiation of the B-cell terminal into the plasma cell has been considered to be a unique identification of the surface of the B-cell. Anti-CD20 monoclonal antibodies bind to CD20 on B-cells and elicit an immune response to B-cell lysis, which may include complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)[2]. The use of monoclonal antibodies against B-cell lymphoma antigen CD20 molecules is an important protocol for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma. Through the global multi-center clinical trial, the survival rate of the tumor patients is obviously improved, the quality of life of the patients is obviously improved, the curative effect of the life cycle is prolonged, and the drug has the characteristics of small toxic and side reaction, compared with the standard tumor treatment drugs adopted at present. To date, at least 500,000 non-Hodgkin's lymphoma patients have received treatment with anti-CD20 monoclonal antibodies, one of the world's most successful antibody drugs, Rituximab for treatment of non-Hodgkin's lymphoma, produced by Roche,[[I]], has a global sales of around $6 billion in 2011, and it is clear that the development of such a drug will provide significant benefits for patients with tumors, and can bring huge economic and social benefits to the biotechnology company for the development of such drugs, and has a wide market prospect. The purpose of this project is to construct an engineering cell bead to express the active ingredient, that is, the recombinant anti-CD20 monoclonal antibody has the same amino acid sequence as the rituximab. A light chain and a heavy chain gene fragment of a recombinant anti-CD20 monoclonal antibody, including a signal peptide, was synthesized according to the literature, and inserted into a pREA202 mammalian cell expression vector, respectively, to construct a vector p REA202/ REA202L and a p REA202/ REA202H expressing an antibody light chain and a heavy chain, respectively. CHO-DG44 cells are co-transfected with the vector of the constructed expression antibody light chain and the heavy chain through the liposome, the positive clone is screened by the G418 resistance, the clone of the high-expression antibody is screened by ELISA, and then the cell strain CHO-REA 202 with a high expression antibody is finally obtained by using the MTX step-by-step pressure screening and cloning. The preliminary identification of the engineering cell line shows that the expression product is intact anti-CD20 monoclonal antibody, and the expression ability of the antibody can reach 20 to 23PCD (pg/ cell/ day). the cell bank is established by the cell line, and after the cell bank of the working cell is recovered, the cell bank is continuously transmitted and cultured, and the stability of the engineering cell is examined. According to the results of the study, the seed cell culture stage was transferred to one generation, and the production and culture stages were each incubated for 48 hours as a generation. The cells were passaged for 60 passages, and the cells of 0, 10, 20, 40 and 60 passages were collected. The results showed that in the course of the passage of CHO-REA202, the DNA sequence of the heavy chain gene of the REA202 protein was not changed; the level of the copy number of the heavy chain gene of the REA202 protein did not change significantly; the growth characteristics, the doubling time and the morphology of the cells did not change significantly; The expression level of the REA202 protein did not change significantly. The results show that the CHO-REA202 of the engineering cell has good passage stability and is in accordance with the requirements for the passage stability of the cell in the Chinese Pharmacopoeia.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.1

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本文編號(hào)：2373156