【摘要】：研究背景和意義結(jié)腸癌在全球男性和女性最常見(jiàn)的腫瘤類型中分別位列第二位和第三位,并且是一種呈現(xiàn)快速進(jìn)展的腫瘤。由于結(jié)腸癌的高侵襲性,20%-50%的結(jié)腸癌患者會(huì)在確診5年內(nèi)因廣泛的腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移而死亡。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌致死的主要因素,以至于50%以上的患者發(fā)展到腫瘤無(wú)法根治性切除的程度。雖然在結(jié)腸癌的早期快速診斷和治療方面已經(jīng)取得一定的進(jìn)展,但是其5年生存率仍然很低,尤其是已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。結(jié)腸癌的分子發(fā)病機(jī)制在很大程度上仍然不清楚,因此,進(jìn)一步地了解結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)改善其治療方案及預(yù)后情況都將有很大的幫助。腫瘤和基質(zhì)之間的相互作用,可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展,這可以通過(guò)多種因素介導(dǎo),其中就包括趨化因子。趨化因子是一類由細(xì)胞分泌至胞外的、低分子量的趨化蛋白的總稱,最初因可以吸引白細(xì)胞趨集到炎癥部位而得名,并在炎癥反應(yīng)、淋巴歸巢以及組織發(fā)育等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Interleukin-8 (IL-8),又稱CXCL8,是人類CXC趨化因子中最具特征和效力的細(xì)胞因子,其在炎癥、感染和其它疾病狀態(tài)中的作用已得到深入研究。IL-8有兩種受體,CXCR1(IL-8RA)和CXCR2 (IL-8RB),廣泛分布于各種正常及異常細(xì)胞膜上。IL-8以高親和度與CXCR1和CXCR2結(jié)合,進(jìn)一步激活下游細(xì)胞通路介導(dǎo)生物學(xué)作用。在腫瘤方面,IL-8可以通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞從而促進(jìn)血管生成、趨化中性粒細(xì)胞至腫瘤部位、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖遷移侵襲、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。眾多研究表明,IL-8在結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌等腫瘤的血管生成、生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。此外,IL-8在多種惡性腫瘤種具有預(yù)后價(jià)值,包括肝癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌和前列腺癌。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞的主要特質(zhì)之一,這其中涉及多種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng),比如侵襲細(xì)胞與相鄰細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用發(fā)生明顯變化,而整合素就是一類介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)作用的一類膜蛋白。整合素是一類異源二聚體跨膜受體的大家族,由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基構(gòu)成,在腫瘤的遷移轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,從而有助于腫瘤的侵襲進(jìn)展。整合素αvβ6是β6亞基可以構(gòu)成的唯一異二聚體,αvβ6一般只表達(dá)于上皮細(xì)胞。整合素αvβ6通常在正常組織中不表達(dá)或者低表達(dá),但在胚胎組織形成、組織修復(fù)以及病理狀態(tài)尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中高表達(dá)。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí),整合素αvβ6可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,抑制腫瘤的凋亡,促進(jìn)腫瘤的定向遷移和侵襲轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌并且在腫瘤化學(xué)耐藥的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明,IL-8與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。IL-8在正常健康組織中幾乎檢測(cè)不到,但在病理狀態(tài)下可被促炎性細(xì)胞因子如TNF-α或者IL-1β迅速誘導(dǎo)表達(dá),而在病理組織中整合素αvβ6同樣被上調(diào)表達(dá)。IL-8促進(jìn)腫瘤侵襲的確切具體機(jī)制以及其與整合素αvβ6的關(guān)系仍不是很清楚,比如IL-8與整合素αvβ6是否存在交互作用。在上述背景下,本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)收集臨床結(jié)腸癌標(biāo)本和臨床病例隨訪,并選擇結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞系,通過(guò)免疫組化、ELISA、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、qRT-PCR、RNA干擾等分子生物化學(xué)方法,在臨床標(biāo)本水平和細(xì)胞分子水平研究探討IL-8與整合素avβ6在結(jié)腸癌遷移侵襲中的角色。第一部分IL-8和整合素αvβ6在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況目的檢測(cè)IL-8和整合素αvβ6在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況,并初步探討兩者的表達(dá)之間是否存在相關(guān)性,以及其與臨床病理因素之間的關(guān)系。方法收集2013年至2014年行根治性手術(shù)的結(jié)腸癌患者30例,于根治性手術(shù)結(jié)束后及時(shí)獲取部分結(jié)腸癌組織及匹配的癌旁正常組織,通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中的IL-8的mRNA及蛋白表達(dá)水平。另隨機(jī)選取2007年到2010年行根治性手術(shù)的結(jié)腸癌患者139例,通過(guò)免疫組化檢測(cè)IL-8和整合素αvβ6的表達(dá)情況,分析IL-8和整合素αvβ6的表達(dá)與不同臨床病理因素間的關(guān)系,并進(jìn)一步利用Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)學(xué)方法初步探討IL-8和整合素αvβ6表達(dá)的相關(guān)性。檢測(cè)具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、WiDr及Caco-2中IL-8和整合素αvβ6的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果通過(guò)對(duì)在30例結(jié)腸癌患者行根治性手術(shù)過(guò)程中獲取的結(jié)腸癌組織及與其匹配的癌旁正常組織進(jìn)行qRT-PCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),IL-8的mRNA及蛋白表達(dá)水平在結(jié)腸癌組織中明顯高于癌旁正常組織。免疫組化檢測(cè)139例原發(fā)性結(jié)腸癌標(biāo)本發(fā)現(xiàn),整合素αvβ6在58例結(jié)腸癌組織中表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率為41.7%,而且αvβ6的免疫染色主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿；IL-8在83例結(jié)腸癌組織中表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率為59.7%,而且IL-8的免疫染色主要位于腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿。臨床隨訪資料統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,IL-8的表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤病理分化程度(p=0.017)、臨床M分期(p=0.004)以及TNM分期(p=0.007)相關(guān),而整合素αvβ6的表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床N分期(p=0.041)、M分期(p=0.012)以及TNM分期(p=0.005)相關(guān)。Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果表明IL-8和整合素αvβ6的免疫組織化學(xué)表達(dá)之間存在著一定的相關(guān)性。IL-8和整合素β6亞基的蛋白表達(dá)水平在HT-29和WiDr中均較高,而在Caco-2中表達(dá)均較低；同時(shí),通過(guò)對(duì)這三種細(xì)胞系的細(xì)胞外培養(yǎng)基提取物進(jìn)行ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HT-29和WiDr細(xì)胞系中的IL-8含量要明顯高于Caco-2。結(jié)論1.IL-8的表達(dá)水平在結(jié)腸癌組織中明顯高于癌旁正常組織,IL-8的表達(dá)與整合素avβ6的表達(dá)之間具有正相關(guān)性。2. 高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和WiDr同時(shí)表達(dá)較高水平的IL-8和整合素αvβ6,而低轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2同時(shí)表達(dá)較低水平的IL-8和整合素αvβ6,間接支持IL-8與整合素αvβ6可能存在相關(guān)性。3. IL-8的表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤病理分化程度、臨床M分期以及TNM分期相關(guān),整合素αvβ6的表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床N分期、M分期以及TNM分期相關(guān),IL-8和整合素αvβ6與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。第二部分IL-8對(duì)整合素αvβ6表達(dá)的影響目的明確IL-8對(duì)整合素αvβ6表達(dá)的影響。方法利用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)外源性或者內(nèi)源性IL-8對(duì)整合素αvvβ6表達(dá)的影響；利用Western blot檢測(cè)IL-8對(duì)ERK 1/2磷酸化和Ets-1活化的影響；利用MEK通路特異性抑制劑U0126或者Ets-1特異性siRNA研究ERK 1/2和Ets-1在IL-8調(diào)控整合素αvβ6表達(dá)過(guò)程中的作用。結(jié)果IL-8以濃度依賴性的方式上調(diào)HT-29及WiDr細(xì)胞中整合素β6亞基的mRNA及蛋白表達(dá)水平,并且CXCR1和CXCR2抗體可顯著抑制該過(guò)程；shRNA技術(shù)干擾IL-8的表達(dá)后,p6亞基的表達(dá)降低。IL-8呈時(shí)間依賴性地促進(jìn)ERK 1/2的磷酸化,MEK通路特異性抑制劑U0126可以顯著抑制IL-8介導(dǎo)的ERK 1/2磷酸化及β6亞基的表達(dá)上調(diào)。IL-8可以促進(jìn)Ets-1磷酸化水平的明顯增加,而U0126可以顯著抑制該過(guò)程,而且Ets-1特異性siRNA可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的整合素αvβ6的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論1.IL-8通過(guò)促進(jìn)ERK 1/2的磷酸化,激活Ets-1對(duì)整合素αvβ6的轉(zhuǎn)錄,從而以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)整合素αvβ6的表達(dá)。2. CXCR1和CXCR2參與IL-8上調(diào)整合素αvβ6表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。第三部分αvβ6在IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用目的明確整合素αvβ6在IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用。方法通過(guò)細(xì)胞劃痕、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)IL-8在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用。運(yùn)用si-RNA及功能性抗體阻斷技術(shù),通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)整合素αvβ6在IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用。分別用MEK通路特異性抑制劑U0126或PD98059、Ets-1特異性siRNA,檢測(cè)ERK 1/2和Ets-1對(duì)IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響。結(jié)果IL-8以濃度依賴性的方式增加HT-29及WiDr細(xì)胞的遷移侵襲,且在IL-8刺激濃度為10ng/ml時(shí)達(dá)到最大效果,CXCR1和CXCR2抗體可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移過(guò)程。整合素αvβ6特異性siRNA或功能阻斷抗體10D5預(yù)處理HT-29及WiDr細(xì)胞后均可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移過(guò)程。MEK通路特異性抑制劑和Ets-1特異性siRNA均可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論1.IL-8通過(guò)誘導(dǎo)整合素αvβ6的表達(dá)上調(diào),從而以濃度依賴性的方式促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移侵襲。2.ERK 1/2和Ets-1通路參與IL-8對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲的調(diào)控過(guò)程。3. CXCR1和CXCR2參與IL-8對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲的調(diào)控過(guò)程。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

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