【摘要】：研究背景和意義結(jié)腸癌在全球男性和女性最常見的腫瘤類型中分別位列第二位和第三位,并且是一種呈現(xiàn)快速進展的腫瘤。由于結(jié)腸癌的高侵襲性,20%-50%的結(jié)腸癌患者會在確診5年內(nèi)因廣泛的腫瘤擴散轉(zhuǎn)移而死亡。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌致死的主要因素,以至于50%以上的患者發(fā)展到腫瘤無法根治性切除的程度。雖然在結(jié)腸癌的早期快速診斷和治療方面已經(jīng)取得一定的進展,但是其5年生存率仍然很低,尤其是已有遠處轉(zhuǎn)移的患者。結(jié)腸癌的分子發(fā)病機制在很大程度上仍然不清楚,因此,進一步地了解結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,對改善其治療方案及預(yù)后情況都將有很大的幫助。腫瘤和基質(zhì)之間的相互作用,可以促進腫瘤的進展,這可以通過多種因素介導(dǎo),其中就包括趨化因子。趨化因子是一類由細胞分泌至胞外的、低分子量的趨化蛋白的總稱,最初因可以吸引白細胞趨集到炎癥部位而得名,并在炎癥反應(yīng)、淋巴歸巢以及組織發(fā)育等生理病理過程中發(fā)揮重要作用。Interleukin-8 (IL-8),又稱CXCL8,是人類CXC趨化因子中最具特征和效力的細胞因子,其在炎癥、感染和其它疾病狀態(tài)中的作用已得到深入研究。IL-8有兩種受體,CXCR1(IL-8RA)和CXCR2 (IL-8RB),廣泛分布于各種正常及異常細胞膜上。IL-8以高親和度與CXCR1和CXCR2結(jié)合,進一步激活下游細胞通路介導(dǎo)生物學(xué)作用。在腫瘤方面,IL-8可以通過刺激血管內(nèi)皮細胞從而促進血管生成、趨化中性粒細胞至腫瘤部位、促進腫瘤細胞的增殖遷移侵襲、抑制腫瘤細胞的凋亡等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。眾多研究表明,IL-8在結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌等腫瘤的血管生成、生長和侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。此外,IL-8在多種惡性腫瘤種具有預(yù)后價值,包括肝癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌和前列腺癌。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞的主要特質(zhì)之一,這其中涉及多種細胞生物學(xué)活動,比如侵襲細胞與相鄰細胞外基質(zhì)的相互作用發(fā)生明顯變化,而整合素就是一類介導(dǎo)腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)作用的一類膜蛋白。整合素是一類異源二聚體跨膜受體的大家族,由一個α亞基和一個β亞基構(gòu)成,在腫瘤的遷移轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,從而有助于腫瘤的侵襲進展。整合素αvβ6是β6亞基可以構(gòu)成的唯一異二聚體,αvβ6一般只表達于上皮細胞。整合素αvβ6通常在正常組織中不表達或者低表達,但在胚胎組織形成、組織修復(fù)以及病理狀態(tài)尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中高表達。我們的前期研究已經(jīng)證實,整合素αvβ6可以促進腫瘤細胞的增殖,抑制腫瘤的凋亡,促進腫瘤的定向遷移和侵襲轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌并且在腫瘤化學(xué)耐藥的過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明,IL-8與結(jié)腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。IL-8在正常健康組織中幾乎檢測不到,但在病理狀態(tài)下可被促炎性細胞因子如TNF-α或者IL-1β迅速誘導(dǎo)表達,而在病理組織中整合素αvβ6同樣被上調(diào)表達。IL-8促進腫瘤侵襲的確切具體機制以及其與整合素αvβ6的關(guān)系仍不是很清楚,比如IL-8與整合素αvβ6是否存在交互作用。在上述背景下,本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上,通過收集臨床結(jié)腸癌標本和臨床病例隨訪,并選擇結(jié)腸癌細胞細胞系,通過免疫組化、ELISA、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、qRT-PCR、RNA干擾等分子生物化學(xué)方法,在臨床標本水平和細胞分子水平研究探討IL-8與整合素avβ6在結(jié)腸癌遷移侵襲中的角色。第一部分IL-8和整合素αvβ6在結(jié)腸癌中的表達情況目的檢測IL-8和整合素αvβ6在結(jié)腸癌中的表達情況,并初步探討兩者的表達之間是否存在相關(guān)性,以及其與臨床病理因素之間的關(guān)系。方法收集2013年至2014年行根治性手術(shù)的結(jié)腸癌患者30例,于根治性手術(shù)結(jié)束后及時獲取部分結(jié)腸癌組織及匹配的癌旁正常組織,通過qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中的IL-8的mRNA及蛋白表達水平。另隨機選取2007年到2010年行根治性手術(shù)的結(jié)腸癌患者139例,通過免疫組化檢測IL-8和整合素αvβ6的表達情況,分析IL-8和整合素αvβ6的表達與不同臨床病理因素間的關(guān)系,并進一步利用Mann-Whitney統(tǒng)計學(xué)方法初步探討IL-8和整合素αvβ6表達的相關(guān)性。檢測具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞HT-29、WiDr及Caco-2中IL-8和整合素αvβ6的蛋白表達情況。結(jié)果通過對在30例結(jié)腸癌患者行根治性手術(shù)過程中獲取的結(jié)腸癌組織及與其匹配的癌旁正常組織進行qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn),IL-8的mRNA及蛋白表達水平在結(jié)腸癌組織中明顯高于癌旁正常組織。免疫組化檢測139例原發(fā)性結(jié)腸癌標本發(fā)現(xiàn),整合素αvβ6在58例結(jié)腸癌組織中表達,陽性表達率為41.7%,而且αvβ6的免疫染色主要位于腫瘤細胞的細胞膜和細胞漿；IL-8在83例結(jié)腸癌組織中表達,陽性表達率為59.7%,而且IL-8的免疫染色主要位于腫瘤細胞和間質(zhì)細胞的細胞漿。臨床隨訪資料統(tǒng)計學(xué)分析表明,IL-8的表達與結(jié)腸癌的腫瘤病理分化程度(p=0.017)、臨床M分期(p=0.004)以及TNM分期(p=0.007)相關(guān),而整合素αvβ6的表達與結(jié)腸癌的臨床N分期(p=0.041)、M分期(p=0.012)以及TNM分期(p=0.005)相關(guān)。Mann-Whitney統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果表明IL-8和整合素αvβ6的免疫組織化學(xué)表達之間存在著一定的相關(guān)性。IL-8和整合素β6亞基的蛋白表達水平在HT-29和WiDr中均較高,而在Caco-2中表達均較低；同時,通過對這三種細胞系的細胞外培養(yǎng)基提取物進行ELISA檢測發(fā)現(xiàn),HT-29和WiDr細胞系中的IL-8含量要明顯高于Caco-2。結(jié)論1.IL-8的表達水平在結(jié)腸癌組織中明顯高于癌旁正常組織,IL-8的表達與整合素avβ6的表達之間具有正相關(guān)性。2. 高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞HT-29和WiDr同時表達較高水平的IL-8和整合素αvβ6,而低轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞Caco-2同時表達較低水平的IL-8和整合素αvβ6,間接支持IL-8與整合素αvβ6可能存在相關(guān)性。3. IL-8的表達與結(jié)腸癌的腫瘤病理分化程度、臨床M分期以及TNM分期相關(guān),整合素αvβ6的表達與結(jié)腸癌的臨床N分期、M分期以及TNM分期相關(guān),IL-8和整合素αvβ6與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。第二部分IL-8對整合素αvβ6表達的影響目的明確IL-8對整合素αvβ6表達的影響。方法利用qRT-PCR和Western blot分別檢測外源性或者內(nèi)源性IL-8對整合素αvvβ6表達的影響；利用Western blot檢測IL-8對ERK 1/2磷酸化和Ets-1活化的影響；利用MEK通路特異性抑制劑U0126或者Ets-1特異性siRNA研究ERK 1/2和Ets-1在IL-8調(diào)控整合素αvβ6表達過程中的作用。結(jié)果IL-8以濃度依賴性的方式上調(diào)HT-29及WiDr細胞中整合素β6亞基的mRNA及蛋白表達水平,并且CXCR1和CXCR2抗體可顯著抑制該過程；shRNA技術(shù)干擾IL-8的表達后,p6亞基的表達降低。IL-8呈時間依賴性地促進ERK 1/2的磷酸化,MEK通路特異性抑制劑U0126可以顯著抑制IL-8介導(dǎo)的ERK 1/2磷酸化及β6亞基的表達上調(diào)。IL-8可以促進Ets-1磷酸化水平的明顯增加,而U0126可以顯著抑制該過程,而且Ets-1特異性siRNA可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的整合素αvβ6的表達上調(diào)。結(jié)論1.IL-8通過促進ERK 1/2的磷酸化,激活Ets-1對整合素αvβ6的轉(zhuǎn)錄,從而以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)整合素αvβ6的表達。2. CXCR1和CXCR2參與IL-8上調(diào)整合素αvβ6表達的調(diào)控過程。第三部分αvβ6在IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞遷移侵襲中的作用目的明確整合素αvβ6在IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞遷移侵襲中的作用。方法通過細胞劃痕、遷移及侵襲實驗,檢測IL-8在結(jié)腸癌細胞遷移侵襲中的作用。運用si-RNA及功能性抗體阻斷技術(shù),通過Transwell遷移實驗檢測整合素αvβ6在IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞遷移侵襲中的作用。分別用MEK通路特異性抑制劑U0126或PD98059、Ets-1特異性siRNA,檢測ERK 1/2和Ets-1對IL-8介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞遷移侵襲的影響。結(jié)果IL-8以濃度依賴性的方式增加HT-29及WiDr細胞的遷移侵襲,且在IL-8刺激濃度為10ng/ml時達到最大效果,CXCR1和CXCR2抗體可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞遷移過程。整合素αvβ6特異性siRNA或功能阻斷抗體10D5預(yù)處理HT-29及WiDr細胞后均可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞的遷移過程。MEK通路特異性抑制劑和Ets-1特異性siRNA均可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞的遷移能力。結(jié)論1.IL-8通過誘導(dǎo)整合素αvβ6的表達上調(diào),從而以濃度依賴性的方式促進結(jié)腸癌細胞的遷移侵襲。2.ERK 1/2和Ets-1通路參與IL-8對結(jié)腸癌細胞遷移侵襲的調(diào)控過程。3. CXCR1和CXCR2參與IL-8對結(jié)腸癌細胞遷移侵襲的調(diào)控過程。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35

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7 宋e，

本文編號：2366819