【摘要】：背景:骨巨細(xì)胞瘤(Giant cell tumor of bone,簡(jiǎn)稱GCTB)是一種具有侵襲性呈膨脹性生長(zhǎng),并且以溶骨性破壞為主要特點(diǎn)的良性骨腫瘤,大約占所有原發(fā)骨腫瘤的5%左右。骨巨細(xì)胞瘤主要有三種細(xì)胞成分構(gòu)成:破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞,單核梭狀基質(zhì)細(xì)胞和圓形的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞來(lái)源的單核細(xì)胞。骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病和復(fù)發(fā)機(jī)制至今仍不清楚,由于少部分骨巨細(xì)胞瘤有惡變或轉(zhuǎn)移的潛能,其生物學(xué)行為及預(yù)后目前難以預(yù)測(cè)。研究表明基質(zhì)細(xì)胞能吸引和促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞分化形成多核巨細(xì)胞,因此目前多認(rèn)為基質(zhì)細(xì)胞是致瘤的重要因素。骨巨細(xì)胞瘤的治療當(dāng)前仍以手術(shù)治療為主,手術(shù)切除的方式主要包括:瘤內(nèi)刮除術(shù)、外科邊緣病灶切除術(shù)以及En-bloc整塊切除術(shù)。盡管完整的手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合雙膦酸鹽的輔助治療能明顯降低骨巨細(xì)胞瘤的局部復(fù)發(fā)率,但目前報(bào)道的27%-65%的局部復(fù)發(fā)率仍不容樂(lè)觀。除去手術(shù)治療,骨巨細(xì)胞瘤對(duì)化療放療均不敏感,這使得當(dāng)腫瘤因?yàn)榻馄饰恢�、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、累及多個(gè)節(jié)段以及功能要求,難以獲得滿意的切除時(shí),缺乏行之有效的輔助治療手段。目前主要的藥物治療有雙膦酸鹽和狄諾塞麥,兩者均以抑制破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞引起的的骨吸收來(lái)發(fā)揮治療作用。對(duì)于致瘤的基質(zhì)細(xì)胞,兩者均無(wú)直接或間接的作用,因而這些治療很難避免腫瘤局部的再次復(fù)發(fā)。此外,骨巨細(xì)胞瘤多伴有豐富的血供和大量的血管新生,臨床上約有10-14%的骨巨細(xì)胞瘤伴有動(dòng)脈瘤樣骨囊腫的形成。因此若能找到同時(shí)抑制多核巨細(xì)胞的分化形成和基質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖,并能抑制血管新生的全新治療方法,將能更加有效地控制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。EGFR是一個(gè)170k Da的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,為erb B(HER)家族成員,又稱為erb Bl/HERl,主要由胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ECD,621個(gè)氨基酸)、跨膜親脂結(jié)構(gòu)域(TM,23個(gè)氨基酸)、胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域(542個(gè)氨基酸)構(gòu)成。受體EGFR識(shí)別并結(jié)合胞外配體后,發(fā)生二聚化和磷酸化,并激活下游的Ras-MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT-m TOR信號(hào)通路、Src-JAK-STATs信號(hào)通路和PLCγ-PKC信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期進(jìn)程、增殖、凋亡、遷移等活動(dòng)。EGFR過(guò)表達(dá)、突變或過(guò)度激活將持續(xù)激活下游信號(hào)通路,引起細(xì)胞異常增殖,血管新生和發(fā)生轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有相關(guān)文獻(xiàn)研究表明EGFR信號(hào)通路在GCTB疾病的發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用,其在基質(zhì)細(xì)胞的增殖,破骨細(xì)胞的形成上可能起著重要的調(diào)控作用。這提示著EGFR信號(hào)通路是一個(gè)潛在的極具價(jià)值的骨巨細(xì)胞瘤治療靶點(diǎn)。研究目的:(一)對(duì)比GCTB腫瘤細(xì)胞與正常人間充質(zhì)干細(xì)胞以及GCTB腫瘤標(biāo)本與正常人松質(zhì)骨中EGFR信號(hào)通路中重要的磷酸化蛋白表達(dá)差異。(二)觀察特異性阻斷EGFR信號(hào)通路對(duì)于GCTB多核巨細(xì)胞的形成、分化的影響。(三)觀察特異性阻斷EGFR信號(hào)通路對(duì)于GCTB基質(zhì)細(xì)胞增殖或凋亡的影響。(四)觀察特異性阻斷EGFR信號(hào)通路對(duì)GCTB條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成的影響;探索GCTB基質(zhì)細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞成熟的機(jī)制和EGFR信號(hào)通路調(diào)控破骨細(xì)胞分化形成的時(shí)間窗。(五)觀察特異性阻斷EGFR信號(hào)通路對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移以及對(duì)GCTB基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管新生的影響。(六)利用動(dòng)物模型觀察特異性阻斷EGFR信號(hào)通路在體內(nèi)對(duì)GCTB治療的效果。研究方法:(一)應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)比GCTB腫瘤細(xì)胞與正常人間充質(zhì)干細(xì)胞以及GCTB腫瘤標(biāo)本與正常人松質(zhì)骨中EGFR信號(hào)通路中重要的磷酸化蛋白表達(dá)差異。(二)應(yīng)用TRAP染色實(shí)驗(yàn)、PCR實(shí)驗(yàn)以及骨片實(shí)驗(yàn)觀察使用酪氨酸激酶抑制劑靶向阻斷EGFR信號(hào)通路后對(duì)GCTB多核巨細(xì)胞的形成及分化的影響。(三)應(yīng)用熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察特異性阻斷EGFR信號(hào)通路對(duì)GCTB基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。(四)應(yīng)用TRAP染色實(shí)驗(yàn)及PCR實(shí)驗(yàn)明確特異性阻斷EGFR信號(hào)通路對(duì)GCTB條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成、分化的影響及機(jī)制。(五)應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、血管新生實(shí)驗(yàn)觀察EGFR信號(hào)通路在HUVECs增殖、遷移以及對(duì)GCTB基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管新生的影響作用。(六)通過(guò)脛骨原位注射荷瘤構(gòu)建GCTB小鼠動(dòng)物模型,給予酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib靶向抑制EGFR信號(hào)通路,觀察其在體內(nèi)對(duì)GCTB溶骨破壞的治療效果;通過(guò)雞胚絨毛尿囊膜荷瘤模型,觀察不同濃度Gefitinib靶向抑制EGFR信號(hào)通路后成瘤的效果。結(jié)果:(一)GCTB腫瘤標(biāo)本及原代細(xì)胞中EGFR信號(hào)通路異常激活。(二)我們利用酪氨酸激酶抑制劑靶向阻斷EGFR信號(hào)通路后,GCTB多核巨細(xì)胞形成以及分化受到明顯抑制,其導(dǎo)致的局部溶骨破壞也被有效抑制,并呈藥物劑量依賴性;隨著藥物濃度上升RANKL的表達(dá)減弱,而OPG的表達(dá)增強(qiáng)。(三)特異性阻斷EGFR信號(hào)通路能有效抑制GCTB基質(zhì)細(xì)胞的增殖,但對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響。(四)特異性阻斷EGFR信號(hào)通路能有效抑制GCTB條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成;EGFR信號(hào)通路主要在破骨細(xì)胞形成的早期階段起調(diào)控作用;基質(zhì)細(xì)胞的EGFR信號(hào)通路被阻斷后,其分泌的細(xì)胞因子:NFATc1、TRAP、MMP9、M-CSF、MCP-1、SDF-1表達(dá)水平明顯下降。(五)阻斷EGFR信號(hào)通路能有效抑制HUVECs的增殖、遷移以及基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管新生。(六)裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:阻斷EGFR信號(hào)通路能有效地抑制GCTB局部的溶骨破壞,Gefitinib在裸鼠體內(nèi)無(wú)明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示:當(dāng)Gefitinib濃度達(dá)到10μM,雞胚絨毛尿囊膜上無(wú)法成瘤。結(jié)論:本研究中我們通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EGFR信號(hào)通路在GCTB中呈異常高表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)應(yīng)用EGFR小分子化合物抑制劑靶向阻斷EGFR信號(hào)通路,觀察到破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞的形成以及基質(zhì)細(xì)胞的增殖和對(duì)單核細(xì)胞的趨化募集作用受到明顯抑制;由基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管新生也得到有效地控制;在小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,抑制EGFR能有效阻止腫瘤對(duì)骨結(jié)構(gòu)的溶骨破壞,且無(wú)明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示,抑制EGFR信號(hào)通路能阻止GCTB的成瘤和血管新生。這一研究結(jié)果提示著EGFR信號(hào)通路在GCTB的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用。目前EGFR靶向抑制劑已在多種惡性腫瘤的臨床治療中得到應(yīng)用,我們期待在不久的將來(lái)EGFR信號(hào)通路能成為GCTB臨床治療的全新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：2365442