【摘要】：背景:骨巨細胞瘤(Giant cell tumor of bone,簡稱GCTB)是一種具有侵襲性呈膨脹性生長,并且以溶骨性破壞為主要特點的良性骨腫瘤,大約占所有原發(fā)骨腫瘤的5%左右。骨巨細胞瘤主要有三種細胞成分構(gòu)成:破骨細胞樣多核巨細胞,單核梭狀基質(zhì)細胞和圓形的單核細胞或巨噬細胞來源的單核細胞。骨巨細胞瘤的發(fā)病和復發(fā)機制至今仍不清楚,由于少部分骨巨細胞瘤有惡變或轉(zhuǎn)移的潛能,其生物學行為及預后目前難以預測。研究表明基質(zhì)細胞能吸引和促進單核-巨噬細胞分化形成多核巨細胞,因此目前多認為基質(zhì)細胞是致瘤的重要因素。骨巨細胞瘤的治療當前仍以手術(shù)治療為主,手術(shù)切除的方式主要包括:瘤內(nèi)刮除術(shù)、外科邊緣病灶切除術(shù)以及En-bloc整塊切除術(shù)。盡管完整的手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合雙膦酸鹽的輔助治療能明顯降低骨巨細胞瘤的局部復發(fā)率,但目前報道的27%-65%的局部復發(fā)率仍不容樂觀。除去手術(shù)治療,骨巨細胞瘤對化療放療均不敏感,這使得當腫瘤因為解剖位置、遠處轉(zhuǎn)移、累及多個節(jié)段以及功能要求,難以獲得滿意的切除時,缺乏行之有效的輔助治療手段。目前主要的藥物治療有雙膦酸鹽和狄諾塞麥,兩者均以抑制破骨細胞樣多核巨細胞引起的的骨吸收來發(fā)揮治療作用。對于致瘤的基質(zhì)細胞,兩者均無直接或間接的作用,因而這些治療很難避免腫瘤局部的再次復發(fā)。此外,骨巨細胞瘤多伴有豐富的血供和大量的血管新生,臨床上約有10-14%的骨巨細胞瘤伴有動脈瘤樣骨囊腫的形成。因此若能找到同時抑制多核巨細胞的分化形成和基質(zhì)細胞瘤的增殖,并能抑制血管新生的全新治療方法,將能更加有效地控制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移。EGFR是一個170k Da的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,為erb B(HER)家族成員,又稱為erb Bl/HERl,主要由胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ECD,621個氨基酸)、跨膜親脂結(jié)構(gòu)域(TM,23個氨基酸)、胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域(542個氨基酸)構(gòu)成。受體EGFR識別并結(jié)合胞外配體后,發(fā)生二聚化和磷酸化,并激活下游的Ras-MAPK信號通路、PI3K-AKT-m TOR信號通路、Src-JAK-STATs信號通路和PLCγ-PKC信號通路,調(diào)節(jié)細胞的周期進程、增殖、凋亡、遷移等活動。EGFR過表達、突變或過度激活將持續(xù)激活下游信號通路,引起細胞異常增殖,血管新生和發(fā)生轉(zhuǎn)移,導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有相關(guān)文獻研究表明EGFR信號通路在GCTB疾病的發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用,其在基質(zhì)細胞的增殖,破骨細胞的形成上可能起著重要的調(diào)控作用。這提示著EGFR信號通路是一個潛在的極具價值的骨巨細胞瘤治療靶點。研究目的:(一)對比GCTB腫瘤細胞與正常人間充質(zhì)干細胞以及GCTB腫瘤標本與正常人松質(zhì)骨中EGFR信號通路中重要的磷酸化蛋白表達差異。(二)觀察特異性阻斷EGFR信號通路對于GCTB多核巨細胞的形成、分化的影響。(三)觀察特異性阻斷EGFR信號通路對于GCTB基質(zhì)細胞增殖或凋亡的影響。(四)觀察特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB條件培養(yǎng)基誘導的破骨細胞的形成的影響;探索GCTB基質(zhì)細胞調(diào)控破骨細胞成熟的機制和EGFR信號通路調(diào)控破骨細胞分化形成的時間窗。(五)觀察特異性阻斷EGFR信號通路對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)增殖、遷移以及對GCTB基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基誘導的血管新生的影響。(六)利用動物模型觀察特異性阻斷EGFR信號通路在體內(nèi)對GCTB治療的效果。研究方法:(一)應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗和免疫組織化學實驗對比GCTB腫瘤細胞與正常人間充質(zhì)干細胞以及GCTB腫瘤標本與正常人松質(zhì)骨中EGFR信號通路中重要的磷酸化蛋白表達差異。(二)應(yīng)用TRAP染色實驗、PCR實驗以及骨片實驗觀察使用酪氨酸激酶抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路后對GCTB多核巨細胞的形成及分化的影響。(三)應(yīng)用熒光染色實驗觀察特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB基質(zhì)細胞增殖的影響,流式細胞實驗觀察其對基質(zhì)細胞凋亡的影響。(四)應(yīng)用TRAP染色實驗及PCR實驗明確特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB條件培養(yǎng)基誘導的破骨細胞的形成、分化的影響及機制。(五)應(yīng)用細胞增殖實驗、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗、Transwell實驗、血管新生實驗觀察EGFR信號通路在HUVECs增殖、遷移以及對GCTB基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基誘導的血管新生的影響作用。(六)通過脛骨原位注射荷瘤構(gòu)建GCTB小鼠動物模型,給予酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib靶向抑制EGFR信號通路,觀察其在體內(nèi)對GCTB溶骨破壞的治療效果;通過雞胚絨毛尿囊膜荷瘤模型,觀察不同濃度Gefitinib靶向抑制EGFR信號通路后成瘤的效果。結(jié)果:(一)GCTB腫瘤標本及原代細胞中EGFR信號通路異常激活。(二)我們利用酪氨酸激酶抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路后,GCTB多核巨細胞形成以及分化受到明顯抑制,其導致的局部溶骨破壞也被有效抑制,并呈藥物劑量依賴性;隨著藥物濃度上升RANKL的表達減弱,而OPG的表達增強。(三)特異性阻斷EGFR信號通路能有效抑制GCTB基質(zhì)細胞的增殖,但對基質(zhì)細胞的凋亡無明顯影響。(四)特異性阻斷EGFR信號通路能有效抑制GCTB條件培養(yǎng)基誘導的破骨細胞的形成;EGFR信號通路主要在破骨細胞形成的早期階段起調(diào)控作用;基質(zhì)細胞的EGFR信號通路被阻斷后,其分泌的細胞因子:NFATc1、TRAP、MMP9、M-CSF、MCP-1、SDF-1表達水平明顯下降。(五)阻斷EGFR信號通路能有效抑制HUVECs的增殖、遷移以及基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基誘導的血管新生。(六)裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果顯示:阻斷EGFR信號通路能有效地抑制GCTB局部的溶骨破壞,Gefitinib在裸鼠體內(nèi)無明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實驗顯示:當Gefitinib濃度達到10μM,雞胚絨毛尿囊膜上無法成瘤。結(jié)論:本研究中我們通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗和免疫組化實驗證實了EGFR信號通路在GCTB中呈異常高表達狀態(tài)。通過應(yīng)用EGFR小分子化合物抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路,觀察到破骨細胞樣多核巨細胞的形成以及基質(zhì)細胞的增殖和對單核細胞的趨化募集作用受到明顯抑制;由基質(zhì)細胞誘導的人血管內(nèi)皮細胞的遷移及血管新生也得到有效地控制;在小鼠動物模型體內(nèi)實驗中,抑制EGFR能有效阻止腫瘤對骨結(jié)構(gòu)的溶骨破壞,且無明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實驗顯示,抑制EGFR信號通路能阻止GCTB的成瘤和血管新生。這一研究結(jié)果提示著EGFR信號通路在GCTB的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用。目前EGFR靶向抑制劑已在多種惡性腫瘤的臨床治療中得到應(yīng)用,我們期待在不久的將來EGFR信號通路能成為GCTB臨床治療的全新靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

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本文編號：2365442