【摘要】：研究背景：盡管不同治療策略的發(fā)展,白血病依舊是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,并且是人類死亡的主要原因。近年來,白血病發(fā)病率和死亡率不斷上升,針對白血病治療藥物的研究越來越重要。姬松茸,又稱為巴西蘑菇,中國也稱為梁金菇,經(jīng)過體外和體內(nèi)的研究,發(fā)現(xiàn)具有包括抗腫瘤、抗病毒、抗炎、保肝、降糖、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)等作用。越來越多的證據(jù)表明,從姬松茸子實(shí)體中提取的多糖和多糖蛋白復(fù)合物在治療和預(yù)防癌癥上,有著很重要的生物活性作用。但是,到目前為止,對于姬松茸子實(shí)體多糖對人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞體外和體內(nèi)作用的具體機(jī)制,還沒有系統(tǒng)的說明�？紤]到這一點(diǎn),我們研究了姬松茸多糖體外對人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60增殖和凋亡的影響和研究多糖的體內(nèi)抑制腫瘤生長的作用。細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩條：內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑,兩者最終都通過激活凋亡執(zhí)行分子：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific protease, Caspase)來實(shí)現(xiàn)。線粒體是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵其作用的細(xì)胞器。Bcl-2家族蛋白例如抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和促凋亡蛋白Bax蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過程中尤其是線粒體途徑中起非常重要的作用。在內(nèi)源性線粒體途徑中,當(dāng)細(xì)胞接到凋亡信號刺激,Bax可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上,在線粒體膜上形成四聚體到十聚體組成的低聚復(fù)合物上,導(dǎo)致線粒體跨膜電位的丟失,介導(dǎo)細(xì)胞色素-c等物質(zhì)的釋放,細(xì)胞色素-c從線粒體膜間釋放到細(xì)胞漿中,與凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor, Apaf-1)結(jié)合,形成凋亡體,激活Caspase-9再激活caspase-3,啟動Caspase-3級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤研究的一個熱點(diǎn)。目的：1.姬松茸是食藥兼用的真菌,它的抗腫瘤活性,己被廣泛的應(yīng)用。多糖是姬松茸治療腫瘤的主要化學(xué)成分,從姬松茸子實(shí)體中提取,純化出姬松茸多糖,來研究它的醫(yī)學(xué)價值。2.通過觀察姬松茸多糖在體外對HL-60細(xì)胞的作用,探討姬松茸多糖抑制HL-60生長的具體機(jī)制。3.通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,通過給裸鼠注射多糖樣品,來觀察其抑制腫瘤生長的效應(yīng),檢測多糖對腫瘤細(xì)胞的殺傷或清除作用,通過計算抑瘤率等指標(biāo)來確定多糖的作用效果。方法：1.本實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)略加改進(jìn)將500g姬松茸子實(shí)體用熱水提取、Sevage法除蛋白、乙醇沉淀、離子交換層層析提純后得到姬松茸多糖,酚-硫法檢測多糖的含量。2.姬松茸多糖體外誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡作用實(shí)驗(yàn)研究。(1)通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察姬松茸多糖對HL-60細(xì)胞的作用。(2)流式細(xì)胞技術(shù)(Annexin V/PI雙染)檢測姬松茸多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。(3)Caspase-3活性檢測試劑盒檢測姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Caspase-3活性的變化。3.姬松茸多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡具體機(jī)制的研究。(1)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞線粒體膜電位變化情況。(2)采用Western blotting方法檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞細(xì)胞色素c(Cyt-c)、Bax蛋白、Bcl-2蛋白、聚-ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase PARP)蛋白的變化。4.姬松茸多糖在體內(nèi)對裸鼠移植瘤模型腫瘤的作用。為了觀察姬松茸多糖在體內(nèi)對白血病細(xì)胞的作用,我們通過皮下接種HL-60細(xì)胞構(gòu)建人白血病細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型,隨機(jī)分成生理鹽水組,治療組、和環(huán)磷酰胺組,定期測量裸鼠體重,觀察裸鼠狀態(tài)和不良反應(yīng),最后,處死裸鼠,稱量腫瘤的重量,通過計算抑瘤率等指標(biāo)來確定多糖的作用效果。結(jié)果：1.500g姬松茸子實(shí)體分離純化獲得42.4g粗多糖,經(jīng)過分離純化得到其中一種多糖,用酚硫法檢測其中的多糖含量為89.2%。2.通過MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姬松茸多糖對HL-60細(xì)胞的增殖有抑制作用,并且隨著藥物濃度的增加,抑制作用增強(qiáng),具有一定的量效關(guān)系。3.流式細(xì)胞技術(shù)(Annexin V/PI雙染)檢測姬松茸多糖誘導(dǎo)人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞凋亡的效應(yīng),發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡率增加,呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。4.通過C aspase-3活性檢測試劑盒檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞, Caspase-3活性增加,并且隨著藥物濃度的增加,活性增強(qiáng),呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞線粒體膜電位變化情況,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,線粒體膜電位丟失增多,呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。6. Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),姬松茸多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞中細(xì)胞色素c從線粒體中釋放至細(xì)胞漿中,細(xì)胞漿中的細(xì)胞色素c增加,促凋亡因子Bax蛋白增加,同時抗凋亡蛋白Bcl-2沒有明顯變化,導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值增加,促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生7. Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),姬松茸多糖處理后的HL-60細(xì)胞,被剪切成89KD的PARP增加,并且均隨著藥物濃度的增加,反應(yīng)增強(qiáng),呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。8.姬松茸多糖裸鼠體內(nèi)抑制HL-60細(xì)胞移植瘤的生長。姬松茸多糖組裸鼠腫瘤生長受到顯著抑制,而體重?zé)o明顯差異,未觀察到明顯毒副反應(yīng),并且隨著治療劑量的增加,抑制腫瘤生長的作用增強(qiáng),具有一定的劑量依賴性。提示姬松茸多糖在一定的劑量和療程內(nèi)具有高效、低毒的抗白血病效應(yīng)。結(jié)論：1.從姬松茸子實(shí)體中通過熱水提取、乙醇沉淀、離子交換層層析提純后,可以得到姬松茸多糖。2.姬松茸多糖在體外能有效的抑制HL-60細(xì)胞的增殖,同時這種抑制細(xì)胞增殖作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的,因此姬松茸多糖在體外有較強(qiáng)的體外抗白血病效應(yīng)。3.本研究探明了姬松茸多糖誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過Caspase依賴的線粒體途徑調(diào)節(jié)的：在姬松茸多糖的作用下,HL-60細(xì)胞的Bax蛋白／Bcl-2蛋白比值增加、促進(jìn)了細(xì)胞凋亡,并且導(dǎo)致線粒體膜電位的降低、細(xì)胞色素c釋放、Caspase-3活性的增強(qiáng)、剪切的PARP片段增多,由此可以推斷凋亡的線粒體途徑在姬松茸多糖抑制人白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。。4.通過在體內(nèi)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)姬松茸多糖能有效地抑制白血病細(xì)胞裸鼠移植瘤模型腫瘤的生長,抑制白血病細(xì)胞的增殖。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張彥民,李寶才,朱利平,戴偉鋒,范家恒;多糖化學(xué)及其生物活性研究進(jìn)展[J];昆明理工大學(xué)學(xué)報(理工版);2003年03期

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本文編號：2358582